Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα

Μεταξύ των περιφερειακών βλαστοκυττάρων, μια ιδιαίτερη θέση κατέχουν τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (MSCs), τα παράγωγα των οποίων αποτελούν τη στρωματική μήτρα όλων των οργάνων και ιστών του ανθρώπινου σώματος. Η προτεραιότητα στην έρευνα για τα MSC ανήκει σε εκπροσώπους της ρωσικής βιολογικής επιστήμης.

Στα μέσα του περασμένου αιώνα, μια ομοιογενής καλλιέργεια πολυδύναμων στρωματικών βλαστοκυττάρων μυελού των οστών απομονώθηκε για πρώτη φορά στο εργαστήριο του A. Friedenstein. Τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα που ήταν προσκολλημένα στο υπόστρωμα διατήρησαν υψηλή ένταση πολλαπλασιασμού για μεγάλο χρονικό διάστημα και σε καλλιέργειες με χαμηλή πυκνότητα σποράς μετά τη στερέωση στο υπόστρωμα σχημάτισαν κλώνους ινοβλαστικών κυττάρων που δεν είχαν φαγοκυτταρική δράση. Η διακοπή του πολλαπλασιασμού των MSC έληξε με την αυθόρμητη διαφοροποίησή τους in vitro σε κύτταρα οστού, λίπους, χόνδρου, μυός ή συνδετικού ιστού. Περαιτέρω μελέτες κατέστησαν δυνατή την τεκμηρίωση του οστεογενετικού δυναμικού των ινοβλαστικών κυττάρων του στρώματος του μυελού των οστών διαφόρων ειδών θηλαστικών, καθώς και της δράσης τους στη δημιουργία αποικιών. Πειράματα in vivo έχουν δείξει ότι τόσο η ετερο- όσο και η ορθοτοπική μεταμόσχευση ινοβλαστικών κυττάρων που σχηματίζουν αποικίες έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό οστού, χόνδρου, ινώδους και λιπώδους ιστού. Δεδομένου ότι τα στρωματικά βλαστοκύτταρα του μυελού των οστών χαρακτηρίζονται από υψηλή ικανότητα αυτοανανέωσης και πολύπλευρης διαφοροποίησης εντός μίας μόνο κυτταρικής σειράς, ονομάζονται πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα.

Πρέπει να σημειωθεί ότι μετά από πάνω από 45 χρόνια βασικής έρευνας στα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα, έχουν δημιουργηθεί πραγματικές συνθήκες για τη χρήση των παραγώγων τους στην κλινική πράξη.

Σήμερα δεν υπάρχει αμφιβολία ότι όλοι οι ιστοί του ανθρώπινου σώματος σχηματίζονται από βλαστοκύτταρα διαφόρων κυτταρικών σειρών ως αποτέλεσμα των διαδικασιών πολλαπλασιασμού, μετανάστευσης, διαφοροποίησης και ωρίμανσης. Ωστόσο, μέχρι πρόσφατα πιστευόταν ότι τα βλαστοκύτταρα σε έναν ενήλικο οργανισμό είναι ιστοειδικά, δηλαδή ικανά να παράγουν σειρές εξειδικευμένων κυττάρων μόνο από εκείνους τους ιστούς στους οποίους βρίσκονται. Αυτή η εννοιολογική θέση διαψεύστηκε από τα γεγονότα του μετασχηματισμού των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων όχι μόνο σε κυτταρικά στοιχεία του περιφερικού αίματος, αλλά και σε οβάλ κύτταρα του ήπατος. Επιπλέον, τα νευρικά βλαστοκύτταρα αποδείχθηκαν ικανά να δημιουργήσουν τόσο νευρώνες όσο και νευρογλοιακά στοιχεία, καθώς και πρώιμες δεσμευμένες σειρές αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων. Με τη σειρά τους, τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα, τα οποία συνήθως παράγουν κυτταρικά στοιχεία οστού, χόνδρου και λιπώδους ιστού, είναι ικανά να μετασχηματιστούν σε νευρικά βλαστοκύτταρα. Υποτίθεται ότι κατά τη διαδικασία ανάπτυξης, φυσιολογικής και επανορθωτικής αναγέννησης ιστών, μη δεσμευμένα προγονικά κύτταρα παράγονται από μη ειδικά αποθέματα βλαστικών ιστών. Για παράδειγμα, η αποκατάσταση του μυϊκού ιστού μπορεί να πραγματοποιηθεί λόγω μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων που μεταναστεύουν από τον μυελό των οστών στους σκελετικούς μύες.

Παρόλο που αυτή η διασταυρούμενη εναλλαξιμότητα των βλαστοκυττάρων δεν αναγνωρίζεται από όλους τους ερευνητές, η πιθανότητα κλινικής χρήσης των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων ως πηγής για μεταμόσχευση κυττάρων και κυτταρικού φορέα γενετικών πληροφοριών δεν αμφισβητείται πλέον από κανέναν, όπως και η πολυδύναμη δράση των στρωματικών βλαστοκυττάρων του μυελού των οστών, τα οποία μπορούν σχετικά εύκολα να απομονωθούν και να επεκταθούν σε in vitro καλλιέργεια. Ταυτόχρονα, στην επιστημονική βιβλιογραφία συνεχίζουν να εμφανίζονται αναφορές σχετικά με την πιθανή πολυδύναμη δράση των στρωματικών βλαστοκυττάρων του μυελού των οστών. Ως αποδεικτικά στοιχεία, αναφέρονται ερευνητικά πρωτόκολλα στα οποία, υπό την επίδραση συγκεκριμένων επαγωγέων διαφοροποίησης, τα MSC μετασχηματίζονται σε νευρικά κύτταρα, καρδιομυοκύτταρα και ηπατοκύτταρα. Ωστόσο, ορισμένοι επιστήμονες έχουν σοβαρές αμφιβολίες σχετικά με την πιθανότητα επαναλαμβανόμενης ενεργοποίησης και έκφρασης γονιδίων από την περίοδο της πρώιμης εμβρυογένεσης. Ταυτόχρονα, όλοι κατανοούν ότι εάν βρεθούν συνθήκες για την επέκταση της πολυδύναμης δράσης των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων στην πολυδύναμη δράση των ενδοκυτταρικών κυττάρων (ΕΒΚ), πολλά ηθικά, θρησκευτικά και νομικά προβλήματα στην αναγεννητική πλαστική ιατρική θα επιλυθούν αυτόματα. Επιπλέον, δεδομένου ότι σε αυτή την περίπτωση η πηγή του αναγεννητικού βλαστικού δυναμικού γίνεται τα αυτόλογα στρωματικά κύτταρα του ασθενούς, λύνεται επίσης το πρόβλημα της ανοσολογικής απόρριψης του κυτταρικού μοσχεύματος. Το εγγύς μέλλον θα δείξει πόσο ρεαλιστικές είναι αυτές οι προοπτικές.

[ 1 ], [ 2 ]

Χρήση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων στην ιατρική

Στην κλινική, η χρήση παραγώγων μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων σχετίζεται κυρίως με την αποκατάσταση ελαττωμάτων ιστού που εμφανίζονται με εκτεταμένες και βαθιές θερμικές αλλοιώσεις του δέρματος. Στο προκλινικό στάδιο, πραγματοποιήθηκε μια πειραματική αξιολόγηση της σκοπιμότητας χρήσης αλλογενών μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με ινοβλάστες για τη θεραπεία βαθιών εγκαυμάτων. Αποδείχθηκε ότι τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με ινοβλάστες μυελού των οστών σχηματίζουν μια μονοστιβάδα σε καλλιέργεια, η οποία καθιστά δυνατή τη μεταμόσχευσή τους για τη βελτιστοποίηση των διαδικασιών αναγέννησης βαθιών εγκαυμάτων. Οι συγγραφείς σημειώνουν ότι οι εμβρυϊκοί ινοβλάστες έχουν παρόμοια ιδιότητα, αλλά η κλινική τους χρήση περιορίζεται από υπάρχοντα ηθικά και νομικά προβλήματα. Ένα βαθύ θερμικό έγκαυμα με βλάβη σε όλα τα στρώματα του δέρματος μοντελοποιήθηκε σε αρουραίους Wistar. Η περιοχή εγκαύματος ήταν 18-20% της συνολικής επιφάνειας του δέρματος. Η πρώτη πειραματική ομάδα περιελάμβανε αρουραίους με βαθύ θερμικό έγκαυμα και μεταμόσχευση αλλογενών μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με ινοβλάστες. Η δεύτερη ομάδα αποτελούνταν από ζώα με βαθύ θερμικό έγκαυμα και μεταμόσχευση αλλογενών εμβρυϊκών ινοβλαστών. Η τρίτη ομάδα αντιπροσωπευόταν από αρουραίους ελέγχου με βαθύ θερμικό έγκαυμα που δεν υποβλήθηκαν σε κυτταρική θεραπεία. Ένα εναιώρημα μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων που μοιάζουν με ινοβλάστες και εμβρυϊκών ινοβλαστών εφαρμόστηκε στην επιφάνεια του εγκαύματος χρησιμοποιώντας μια πιπέτα σε ποσότητα 2 x 104 ^.κύτταρα τη 2η ημέρα μετά τη μοντελοποίηση του εγκαύματος και την εκτομή της νεκρωτικής κρούστας που προέκυψε. Μετά τη μεταμόσχευση κυττάρων, η επιφάνεια του εγκαύματος καλύφθηκε με μια πετσέτα γάζας υγραμένη με ισότονο διάλυμα χλωριούχου νατρίου με γενταμικίνη. Συλλέχθηκαν κύτταρα μυελού των οστών για τη λήψη MSCs και στη συνέχεια η επαγωγή τους σε μια σειρά μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με ινοβλάστες από ενήλικους αρουραίους Wistar από μηριαία οστά. Εμβρυϊκοί ινοβλάστες ελήφθησαν από τους πνεύμονες εμβρύων ηλικίας 14-17 ημερών. Οι εμβρυϊκοί ινοβλάστες και τα κύτταρα μυελού των οστών για τη λήψη MSCs καλλιεργήθηκαν προκαταρκτικά σε τρυβλία Petri σε θερμοκρασία 37°C σε επωαστήρα CO2, σε ατμόσφαιρα με 5% CO2 και υγρασία 95%. Οι εμβρυϊκοί ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν για 4-6 ημέρες, ενώ ο σχηματισμός μιας μονοστοιβάδας MSCs απαιτούσε από 14 έως 17 ημέρες. Στη συνέχεια, τα MSCs κρυοσυντηρήθηκαν ως υλικό πηγής για μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα που μοιάζουν με ινοβλάστες, τα οποία ελήφθησαν με απόψυξη και καλλιέργεια MSCs για 4 ημέρες. Ο αριθμός των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων που σχηματίστηκαν ήταν περισσότερο από 3 φορές υψηλότερος από τον αριθμό των εμβρυϊκών ινοβλαστών που σχηματίστηκαν κατά την ίδια περίοδο καλλιέργειας. Για την ταυτοποίηση των μεταμοσχευμένων κυττάρων σε εγκαύματα στο στάδιο της καλλιέργειας, το γονιδίωμά τους επισημάνθηκε χρησιμοποιώντας ένα ιικό φορέα μεταφοράς βασισμένο σε ανασυνδυασμένο αδενοϊό τύπου V που φέρει το γονίδιο 1ac-2 που κωδικοποιεί τη β-γαλακτοσιδάση του E. coli. Ζωντανά κύτταρα σε διαφορετικούς χρόνους μετά τη μεταμόσχευση ανιχνεύθηκαν ανοσοϊστοχημικά σε κρυοτομές με την προσθήκη υποστρώματος X-Gal, το οποίο δίνει μια χαρακτηριστική μπλε-πράσινη χρώση. Ως αποτέλεσμα της δυναμικής οπτικής, πλινμετρικής και ιστολογικής αξιολόγησης της κατάστασης του εγκαύματος, διαπιστώθηκε ότι ήδη την 3η ημέρα μετά τη μεταμόσχευση κυττάρων, εμφανίζονται σημαντικές διαφορές στην πορεία της διαδικασίας του τραύματος στις επιλεγμένες ομάδες. Αυτή η διαφορά έγινε ιδιαίτερα έντονη την 7η ημέρα μετά τη μεταμόσχευση κυττάρων. Στα ζώα της πρώτης ομάδας, στα οποία μεταμοσχεύθηκαν μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα που μοιάζουν με ινοβλάστες, το τραύμα απέκτησε ομοιόμορφα έντονο ροζ χρώμα, ο κοκκιώδης ιστός αναπτύχθηκε σε ολόκληρη την περιοχή του μέχρι το επίπεδο της επιδερμίδας και η επιφάνεια του εγκαύματος μειώθηκε σημαντικά σε μέγεθος. Η μεμβράνη κολλαγόνου που σχηματίστηκε στην επιφάνεια του τραύματος έγινε κάπως λεπτότερη, αλλά συνέχισε να καλύπτει ολόκληρη την περιοχή του εγκαύματος. Στα ζώα της δεύτερης ομάδας, στα οποία μεταμοσχεύθηκαν εμβρυϊκοί ινοβλάστες, ο κοκκιώδης ιστός ανέβηκε στο επίπεδο της επιδερμίδας των άκρων του τραύματος, αλλά μόνο σε ορισμένα σημεία, ενώ η πλασμόρροια από το τραύμα ήταν πιο έντονη από ό,τι στην 1η ομάδα και η αρχικά σχηματισμένη μεμβράνη κολλαγόνου πρακτικά εξαφανίστηκε. Στα ζώα που δεν έλαβαν κυτταρική θεραπεία, την 7η ημέρα το τραύμα του εγκαύματος ήταν ωχρός, με κοιλώματα, νεκρωτικός ιστός καλυμμένος με ινώδες. Παρατηρήθηκε πλασμορεία σε ολόκληρη την επιφάνεια του εγκαύματος. Ιστολογικά, τα ζώα της 1ης και 2ης ομάδας έδειξαν μείωση στην κυτταρική διήθηση και ανάπτυξη του αγγειακού δικτύου,και αυτά τα σημάδια της αρχικής αναγεννητικής διαδικασίας ήταν πιο έντονα στους αρουραίους της 1ης ομάδας. Στην ομάδα ελέγχου, παρατηρήθηκαν σημάδια κυτταρικής διήθησης του τραύματος, απουσίαζε το ιστολογικό πρότυπο νεοσχηματισμένων αγγείων. Την 15η-30ή ημέρα παρατήρησης, η περιοχή της επιφάνειας εγκαύματος στα ζώα της 1ης ομάδας ήταν σημαντικά μικρότερη από ό,τι στους αρουραίους των άλλων ομάδων και η επιφάνεια κοκκοποίησης ήταν πιο ανεπτυγμένη. Στα ζώα της 2ης ομάδας, η περιοχή της επιφάνειας εγκαύματος μειώθηκε επίσης σε σύγκριση με το μέγεθος των εγκαυματικών τραυμάτων στους αρουραίους της ομάδας ελέγχου, κάτι που συνέβη λόγω οριακής επιθηλιοποίησης. Στην ομάδα ελέγχου, η επιφάνεια εγκαύματος παρέμεινε ωχρή σε σημεία με σπάνιες κοκκιώσεις, εμφανίστηκαν αγγειακοί αστερίσκοι σε αυτήν, υπήρχαν νησίδια ινώδους πλάκας, μέτρια πλασμόρροια συνεχίστηκε σε ολόκληρη την επιφάνεια εγκαύματος και μια κρούστα που ήταν δύσκολο να διαχωριστεί παρέμεινε σε ορισμένα σημεία. Γενικά, στα ζώα της 3ης ομάδας, το μέγεθος του τραύματος μειώθηκε επίσης, αλλά οι άκρες του τραύματος παρέμειναν υποβαθμισμένες.

Έτσι, κατά τη διάρκεια μιας συγκριτικής μελέτης του ρυθμού επούλωσης τραυμάτων χρησιμοποιώντας μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα που μοιάζουν με ινοβλάστες και εμβρυϊκούς ινοβλάστες, καθώς και χωρίς τη χρήση κυτταρικής θεραπείας, παρατηρήθηκε επιτάχυνση του ρυθμού επούλωσης της επιφάνειας του εγκαύματος ως αποτέλεσμα της μεταμόσχευσης μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων που μοιάζουν με ινοβλάστες και εμβρυϊκών ινοβλαστών. Ωστόσο, στην περίπτωση χρήσης αλλογενών μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων που μοιάζουν με ινοβλάστες, ο ρυθμός επούλωσης τραυμάτων ήταν υψηλότερος από ό,τι με τη μεταμόσχευση εμβρυϊκών ινοβλαστών. Αυτό εκφράστηκε στην επιτάχυνση της αλλαγής των φάσεων της αναγεννητικής διαδικασίας - οι χρόνοι κυτταρικής διήθησης μειώθηκαν, ο ρυθμός ανάπτυξης του αγγειακού δικτύου αυξήθηκε, καθώς και ο σχηματισμός κοκκιώδους ιστού.

Τα αποτελέσματα της δυναμικής πλανιμετρίας δείχνουν ότι ο ρυθμός αυθόρμητης επούλωσης του εγκαύματος (χωρίς τη χρήση κυτταρικής θεραπείας) ήταν ο χαμηλότερος. Την 15η και 30ή ημέρα μετά τη μεταμόσχευση αλλογενών μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων τύπου ινοβλαστών, ο ρυθμός επούλωσης του τραύματος ήταν υψηλότερος από ό,τι με τη μεταμόσχευση εμβρυϊκών ινοβλαστών. Η ιστοχημική μέθοδος για την ανίχνευση βήτα-γαλακτοσιδάσης έδειξε ότι μετά τη μεταμόσχευση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων τύπου ινοβλαστών και εμβρυϊκών ινοβλαστών, τα μεταμοσχευμένα κύτταρα παραμένουν βιώσιμα στην επιφάνεια και στο βάθος των αναγεννημένων τραυμάτων καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης. Οι συγγραφείς πιστεύουν ότι ο υψηλότερος ρυθμός αναγέννησης εγκαύματος με τη χρήση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων τύπου ινοβλαστών οφείλεται στην απελευθέρωση βιολογικά ενεργών παραγόντων διέγερσης της ανάπτυξης από αυτά τα κύτταρα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ωρίμανσης.

Η μεταμόσχευση αυτο- ή αλλογενών κερατινοκυττάρων και αλλογενών ινοβλαστών για τη θεραπεία εγκαυμάτων έχει επίσης χρησιμοποιηθεί στην κλινική πράξη. Πρέπει να σημειωθεί ότι η χειρουργική θεραπεία παιδιών με εκτεταμένα βαθιά εγκαύματα είναι ένα πολύπλοκο έργο λόγω της υψηλής τραυματικής φύσης και των πολλαπλών χειρουργικών επεμβάσεων, της σημαντικής απώλειας αίματος και των διαφόρων αντιδράσεων στα χρησιμοποιούμενα μέσα έγχυσης. Οι κύριες δυσκολίες στην εκτέλεση πλαστικών χειρουργικών επεμβάσεων δέρματος για εκτεταμένα βαθιά εγκαύματα, με επιφάνεια που υπερβαίνει το 40% της επιφάνειας του σώματος, οφείλονται στη σοβαρότητα της κατάστασης των θυμάτων και στην έλλειψη πόρων δέρματος δότη. Η χρήση μοσχευμάτων πλέγματος με υψηλό συντελεστή διάτρησης δεν λύει το πρόβλημα, καθώς τα κύτταρα που σχηματίζονται μετά τη διάτρηση επιθηλιώνονται πολύ αργά και τα ίδια τα δερματικά πτερύγια συχνά λύονται ή στεγνώνουν. Τέτοιες επικαλύψεις εγκαυμάτων όπως το ξενόδερμα, τα αλλομοσχεύματα πτωμάτων, οι επικαλύψεις συνθετικής μεμβράνης δεν είναι πάντα αρκετά αποτελεσματικές, επομένως αναπτύσσονται νέες μέθοδοι κάλυψης επιφανειών εγκαυμάτων με στρώματα καλλιεργημένων κερατινοκυττάρων και ινοβλαστών. Συγκεκριμένα, έχει προταθεί μια μέθοδος κάλυψης επιφανειών εγκαυμάτων με τη βοήθεια καλλιεργημένων αλλοϊνοβλαστών, οι οποίοι, όταν μεταμοσχευθούν, έχουν έντονη διεγερτική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των επιδερμοκυττάρων που διατηρούνται στο τραύμα σε οριακά εγκαύματα, καθώς και των κερατινοκυττάρων στα διαφράγματα των μοσχευμάτων πλέγματος. Η εργασία του L. Budkevich και των συν-συγγραφέων (2000) παρουσιάζει τα αποτελέσματα της χρήσης αυτής της μεθόδου για τη θεραπεία εγκαυμάτων σε παιδιά. Η μελέτη περιελάμβανε 31 παιδιά με θερμικό τραύμα ηλικίας από 1 έτους έως 14 ετών. Σε τρία παιδιά, η συνολική επιφάνεια των εγκαυμάτων βαθμού IIIA-B - IV ήταν 40%, σε 25 - 50-70%, σε άλλα τρία - 71-85% της επιφάνειας του σώματος. Η πρώιμη χειρουργική νεκρεκτομή συνδυάστηκε με μεταμόσχευση καλλιεργημένων αλλοϊνοβλαστών και αυτοδερμοπλαστική. Το πρώτο στάδιο της θεραπείας περιελάμβανε την εκτομή νεκρωτικών ιστών, το δεύτερο στάδιο περιελάμβανε μεταμόσχευση καλλιεργημένων αλλοϊνοβλαστών σε μεμβράνες-φορείς και το τρίτο στάδιο (48 ώρες μετά τη μεταμόσχευση καλλιεργημένων αλλοϊνοβλαστών) περιελάμβανε την αφαίρεση της μήτρας και την αυτοδερμοπλαστική με δερματικά πτερύγια με αναλογία διάτρησης 1:4. Τρεις ασθενείς που εισήχθησαν στην κλινική με σοβαρή εγκαυματική νόσο είχαν καλλιεργημένες αλλοϊνοβλάστες που είχαν μεταμοσχευθεί σε κοκκιώδη τραύματα. Η μεταμόσχευση καλλιεργημένων αλλοϊνοβλαστών πραγματοποιήθηκε μία φορά σε 18 παιδιά, δύο φορές σε 11 παιδιά και τρεις φορές σε δύο ασθενείς. Η επιφάνεια του τραύματος που καλύφθηκε με κυτταροκαλλιέργεια κυμαινόταν από 30 έως 3500 cm2. Η αποτελεσματικότητα των καλλιεργημένων αλλοϊνοβλαστών αξιολογήθηκε με βάση το συνολικό ποσοστό ενσωμάτωσης δερματικού μοσχεύματος, τους χρόνους επούλωσης εγκαύματος και τον αριθμό των θανάτων από σοβαρό θερμικό τραύμα. Η ενσωμάτωση του μοσχεύματος ήταν πλήρης στο 86% των ασθενών. Μερική μη ενσωμάτωση δερματικών μοσχευμάτων παρατηρήθηκε στο 14% των περιπτώσεων. Παρά τη θεραπεία, έξι (19,3%) παιδιά απεβίωσαν. Η συνολική έκταση της βλάβης του δέρματος σε αυτά κυμαινόταν από 40 έως 70% της επιφάνειας του σώματος.Η μεταμόσχευση καλλιεργημένων αλλοϊνοβλαστών δεν συσχετίστηκε με θνησιμότητα σε εγκαύματα σε κανέναν ασθενή.

Αναλύοντας τα αποτελέσματα της θεραπείας, οι συγγραφείς σημειώνουν ότι η προηγουμένως βαθιά θερμική βλάβη του δέρματος που κάλυπτε το 35-40% της επιφάνειας του σώματος θεωρούνταν ασύμβατη με τη ζωή (για μικρότερα παιδιά - έως 3 ετών - τα βαθιά εγκαύματα που καλύπτουν το 30% της επιφάνειας του σώματος είναι κρίσιμα, για μεγαλύτερα παιδιά - πάνω από το 40% της επιφάνειας του σώματος). Κατά την εκτέλεση χειρουργικής νεκρεκτομής με μεταμόσχευση καλλιεργημένων αλλοϊνοβλαστών και επακόλουθη αυτοδερμοπλαστική με δερματικά πτερύγια με υψηλό συντελεστή διάτρησης, τα εγκαύματα βαθμού IIIB - IV παραμένουν κρίσιμα, αλλά προς το παρόν υπάρχουν προοπτικές για τη διάσωση της ζωής ακόμη και τέτοιων θυμάτων σε πολλές περιπτώσεις. Η χειρουργική νεκρεκτομή σε συνδυασμό με μεταμόσχευση καλλιεργημένων αλλοϊνοβλαστών και αυτοδερμοπλαστική σε παιδιά με βαθιά εγκαύματα έχει αποδειχθεί ιδιαίτερα αποτελεσματική σε ασθενείς με εκτεταμένες δερματικές αλλοιώσεις με έλλειψη θέσεων δότη. Οι ενεργές χειρουργικές τακτικές και η μεταμόσχευση καλλιεργημένων αλλοϊνοβλαστών συμβάλλουν στην ταχεία σταθεροποίηση της γενικής κατάστασης τέτοιων ασθενών, στη μείωση του αριθμού των μολυσματικών επιπλοκών της εγκαυματικής νόσου, στη δημιουργία ευνοϊκών συνθηκών για την ενσωμάτωση μοσχευμάτων, στη μείωση του χρόνου αποκατάστασης του χαμένου δέρματος και της διάρκειας της νοσηλείας, στη μείωση της συχνότητας των θανατηφόρων αποτελεσμάτων σε θύματα με εκτεταμένα εγκαύματα. Έτσι, η μεταμόσχευση καλλιεργημένων αλλοϊνοβλαστών με επακόλουθη αυτοδερμοπλαστική με δερματικά πτερύγια επιτρέπει την ανάρρωση σε παιδιά με σοβαρά εγκαύματα, τα οποία προηγουμένως θεωρούνταν καταδικασμένα.

Είναι γενικά αποδεκτό ότι ο πρωταρχικός στόχος της θεραπείας της εγκαυματικής νόσου είναι η πληρέστερη και ταχύτερη αποκατάσταση του κατεστραμμένου δέρματος για την πρόληψη τοξικών επιδράσεων, μολυσματικών επιπλοκών και αφυδάτωσης. Τα αποτελέσματα της χρήσης καλλιεργημένων κυττάρων εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από την ετοιμότητα του ίδιου του εγκαυματικού τραύματος για μεταμόσχευση. Σε περιπτώσεις μεταμόσχευσης καλλιεργημένων κερατινοκυττάρων στην επιφάνεια του τραύματος μετά από χειρουργική νεκρεκτομή, κατά μέσο όρο 55% (ανά περιοχή) των μεταμοσχευμένων κυττάρων εμφυτεύονται, ενώ με τα κοκκιώδη τραύματα το ποσοστό εμφυτεύσεως μειώνεται στο 15%. Επομένως, η επιτυχής θεραπεία εκτεταμένων βαθιών εγκαυμάτων του δέρματος απαιτεί, πρώτα απ 'όλα, ενεργές χειρουργικές τακτικές. Παρουσία εγκαυμάτων βαθμού IIIB-IV, η επιφάνεια του εγκαύματος απελευθερώνεται αμέσως από τον νεκρωτικό ιστό προκειμένου να μειωθεί η δηλητηρίαση και να μειωθεί ο αριθμός των επιπλοκών της εγκαυματικής νόσου. Η χρήση τέτοιων τακτικών είναι το κλειδί για τη μείωση του χρόνου από τη στιγμή της λήψης ενός εγκαύματος μέχρι το κλείσιμο των τραυμάτων και της διάρκειας παραμονής των ασθενών με εκτεταμένα εγκαύματα στο νοσοκομείο, και επίσης μειώνει σημαντικά τον αριθμό των θανατηφόρων αποτελεσμάτων.

Οι πρώτες αναφορές για την επιτυχή χρήση καλλιεργημένων κερατινοκυττάρων για την κάλυψη επιφανειών εγκαυμάτων εμφανίστηκαν στις αρχές της δεκαετίας του 1980. Στη συνέχεια, αυτός ο χειρισμός πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας στρώματα καλλιεργημένων κερατινοκυττάρων, τα οποία λαμβάνονται συχνότερα από αυτοκύτταρα, πολύ λιγότερο συχνά από αλλοκερατινοκύτταρα. Ωστόσο, η τεχνολογία της αυτοκερατινοπλαστικής δεν επιτρέπει τη δημιουργία τράπεζας κυττάρων, ενώ ο χρόνος που απαιτείται για την παραγωγή μοσχεύματος κερατινοκυττάρων επαρκούς επιφάνειας είναι μεγάλος και ανέρχεται σε 3-4 εβδομάδες. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, ο κίνδυνος εμφάνισης μολυσματικών και άλλων επιπλοκών της εγκαυματικής νόσου αυξάνεται απότομα, γεγονός που παρατείνει σημαντικά τον συνολικό χρόνο παραμονής των ασθενών στο νοσοκομείο. Επιπλέον, τα αυτοκερατινοκύτταρα πρακτικά δεν ριζώνουν όταν μεταμοσχεύονται σε κοκκιώδη εγκαύματα, και το υψηλό κόστος ειδικών μέσων ανάπτυξης και βιολογικά ενεργών διεγερτών ανάπτυξης κερατινοκυττάρων περιορίζει σημαντικά την κλινική τους χρήση. Άλλες βιοτεχνολογικές μέθοδοι, όπως η κολλαγόνοπλαστική, η μεταμόσχευση κρυοσυντηρημένου ξενόδερμου και η χρήση διαφόρων βιοπολυμερικών επικαλύψεων, αυξάνουν την αποτελεσματικότητα της θεραπείας εκτεταμένων επιφανειακών, αλλά όχι βαθιών εγκαυμάτων. Η μέθοδος κάλυψης της επιφάνειας του τραύματος με καλλιεργημένους ινοβλάστες είναι θεμελιωδώς διαφορετική, καθώς οι ινοβλάστες, αντί για τα κερατινοκύτταρα, χρησιμοποιούνται ως το κύριο συστατικό του στρώματος καλλιεργημένων κυττάρων.

Προϋπόθεση για την ανάπτυξη της μεθόδου ήταν τα δεδομένα ότι τα περικύτταρα που περιβάλλουν μικρά αγγεία είναι προγονικά μεσεγχυματικά κύτταρα ικανά να μετασχηματιστούν σε ινοβλάστες που παράγουν πολλούς αυξητικούς παράγοντες και διασφαλίζουν την επούλωση τραυμάτων λόγω ισχυρής διεγερτικής επίδρασης στον πολλαπλασιασμό και την προσκόλληση των κερατινοκυττάρων. Η χρήση καλλιεργημένων ινοβλαστών για το κλείσιμο των επιφανειών του τραύματος αποκάλυψε αμέσως μια σειρά από σημαντικά πλεονεκτήματα αυτής της μεθόδου σε σύγκριση με τη χρήση καλλιεργημένων κερατινοκυττάρων. Συγκεκριμένα, η λήψη ινοβλαστών σε καλλιέργεια δεν απαιτεί τη χρήση ειδικών θρεπτικών μέσων και διεγερτικών ανάπτυξης, γεγονός που μειώνει το κόστος της μεταμόσχευσης κατά περισσότερο από 10 φορές σε σύγκριση με το κόστος λήψης κερατινοκυττάρων. Οι ινοβλάστες παθητικοποιούνται εύκολα, κατά τη διάρκεια της οποίας χάνουν εν μέρει τα αντιγόνα ιστοσυμβατότητας της επιφάνειας, γεγονός που με τη σειρά του ανοίγει τη δυνατότητα χρήσης αλλογενών κυττάρων για την κατασκευή μοσχευμάτων και τη δημιουργία των τραπεζών τους. Ο χρόνος που απαιτείται για την απόκτηση μοσχευμάτων έτοιμων για χρήση σε μια κλινική μειώνεται από 3 εβδομάδες (για κερατινοκύτταρα) σε 1-2 ημέρες (για ινοβλάστες). Μια πρωτογενής καλλιέργεια ινοβλαστών μπορεί να ληφθεί καλλιεργώντας κύτταρα από θραύσματα δέρματος που λαμβάνονται κατά την αυτοδερμοπλαστική και η πυκνότητα σποράς κυττάρων για τη λήψη υποκαλλιεργειών ανθρώπινων ινοβλαστών είναι μόνο 20 x 103 ^ανά 1 ^cm2.

Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση των ινοβλαστών και των ρυθμιστικών τους πρωτεϊνών στον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων, πραγματοποιήθηκε συγκριτική ανάλυση της μορφολογίας και του πολλαπλασιασμού των κερατινοκυττάρων σε υποστρώματα κολλαγόνου τύπου Ι και III, καθώς και φιμπρονεκτίνης σε κοινή καλλιέργεια με ανθρώπινους ινοβλάστες. Ανθρώπινα κερατινοκύτταρα απομονώθηκαν από θραύσματα δέρματος ασθενών με εγκαύματα, που ελήφθησαν κατά τη διάρκεια αυτοδερμοπλαστικής. Η πυκνότητα σποράς κερατινοκυττάρων ήταν 50 x 103 κύτταρα ανά 1 cm2. Η κλινική αποτελεσματικότητα της μεταμόσχευσης καλλιεργημένων ινοβλαστών αξιολογήθηκε σε 517 ασθενείς. Όλοι οι ασθενείς χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: Ομάδα 1 - ενήλικα θύματα με εγκαύματα βαθμού IIA, B - IV. Ομάδα 2 - παιδιά με βαθιά εγκαύματα βαθμού IIIB - IV. Η αξιολόγηση της δυναμικής της δομικής και λειτουργικής οργάνωσης των ινοβλαστών μονοστρωματικής καλλιέργειας, λαμβάνοντας υπόψη τον ρόλο των γλυκοζαμινογλυκανών, της φιμπρονεκτίνης και του κολλαγόνου στις διαδικασίες αναγέννησης, επέτρεψε στους συγγραφείς να προσδιορίσουν την 3η ημέρα ως την πιο ευνοϊκή περίοδο για τη χρήση καλλιεργειών ινοβλαστών για την πραγματοποίηση μεταμοσχεύσεων. Μια μελέτη της επίδρασης των ινοβλαστών στον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων έδειξε ότι οι ινοβλάστες in vitro έχουν έντονη διεγερτική δράση, κυρίως στις διαδικασίες προσκόλλησης των κερατινοκυττάρων, αυξάνοντας τον αριθμό των προσκολλημένων κυττάρων και τον ρυθμό στερέωσής τους περισσότερο από 2 φορές. Η διέγερση των διαδικασιών προσκόλλησης συνοδεύεται από αύξηση της έντασης της σύνθεσης DNA και του επιπέδου πολλαπλασιασμού των κερατινοκυττάρων. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι η παρουσία ινοβλαστών και της εξωκυτταρικής μήτρας που σχηματίζεται από αυτούς είναι απαραίτητη προϋπόθεση για τον σχηματισμό της τονοϊνιδιακής συσκευής των κερατινοκυττάρων, των διακυτταρικών συνδέσεων και, τελικά, για τη διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων και τον σχηματισμό της βασικής μεμβράνης. Στη θεραπεία παιδιών με βαθιά εγκαύματα, έχει αποδειχθεί υψηλή κλινική αποτελεσματικότητα της μεταμόσχευσης καλλιέργειας αλλοϊνοβλαστών, ειδικά στην ομάδα ασθενών με εκτεταμένες δερματικές αλλοιώσεις σε συνθήκες ανεπάρκειας της θέσης του δότη. Μια ολοκληρωμένη μορφολειτουργική μελέτη έδειξε ότι οι ινοβλάστες μεταμόσχευσης χαρακτηρίζονται από ενεργή σύνθεση DNA, καθώς και κολλαγόνου, φιμπρονεκτίνης και γλυκοζαμινογλυκανών, τα οποία αποτελούν μέρος της εξωκυτταρικής μήτρας που σχηματίζεται από τα κύτταρα. Οι συγγραφείς επισημαίνουν ένα υψηλό ποσοστό ενσωμάτωσης μεταμοσχευμένων ινοβλαστών (έως και 96%), μια απότομη μείωση του χρόνου παραλαβής τους (εντός 24-48 ωρών αντί για 2-3 εβδομάδες στην περίπτωση χρήσης κερατινοκυττάρων), μια σημαντική επιτάχυνση της επιθηλιοποίησης της επιφάνειας του εγκαύματος, καθώς και μια σημαντική μείωση του κόστους (κατά 10 φορές) της τεχνολογίας για την ανάπτυξη μοσχεύματος από ινοβλάστες σε σύγκριση με τη μεταμόσχευση κερατινοκυττάρων. Η χρήση μεταμόσχευσης καλλιεργημένων αλλοϊνοβλαστών καθιστά δυνατή τη διάσωση της ζωής παιδιών με κρίσιμα εγκαύματα - θερμική βλάβη σε περισσότερο από 50% της επιφάνειας του σώματος,η οποία προηγουμένως θεωρούνταν ασύμβατη με τη ζωή. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι με τη μεταμόσχευση αλλογενών εμβρυϊκών ινοβλαστών, όχι μόνο η ταχύτερη αναγέννηση τραυμάτων και η ανάρρωση ασθενών με ποικίλους βαθμούς και περιοχές εγκαυμάτων, αλλά και η σημαντική μείωση της θνησιμότητας τους έχουν επίσης αποδειχθεί πειστικά.

Οι αυτόλογοι ινοβλάστες χρησιμοποιούνται επίσης σε έναν τόσο σύνθετο τομέα της πλαστικής χειρουργικής όπως η επανορθωτική διόρθωση τραυματισμών των φωνητικών χορδών. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιείται συνήθως βόειο κολλαγόνο, η διάρκεια δράσης του οποίου περιορίζεται από την ανοσογονικότητά του. Όντας ξένη πρωτεΐνη, το βόειο κολλαγόνο είναι ευαίσθητο στην κολλαγενάση του λήπτη και μπορεί να προκαλέσει ανοσολογικές αντιδράσεις, για τη μείωση του κινδύνου των οποίων αναπτύχθηκαν τεχνολογίες για την απόκτηση παρασκευασμάτων κολλαγόνου διασταυρωμένα με γλουταραλδεΰδη. Το πλεονέκτημά τους έγκειται στη μεγαλύτερη σταθερότητα και τη χαμηλότερη ανοσογονικότητα, η οποία έχει βρει πρακτική εφαρμογή στην εξάλειψη ελαττωμάτων και ατροφίας των φωνητικών χορδών. Οι ενέσεις αυτόλογου κολλαγόνου χρησιμοποιήθηκαν για πρώτη φορά το 1995. Η τεχνική εξασφάλισε τη διατήρηση της πρωτοταγούς δομής των αυτόλογων ινών κολλαγόνου, συμπεριλαμβανομένων των ενδομοριακών ενζυματικά καταλυόμενων διασυνδέσεων. Το γεγονός είναι ότι οι φυσικές ίνες κολλαγόνου είναι πιο ανθεκτικές στην καταστροφή από πρωτεάσες από το ανασυσταμένο κολλαγόνο, στο οποίο κόβονται τα τελοπεπτίδια. Η ακεραιότητα των τελοπεπτιδίων είναι σημαντική για την τεταρτοταγή δομή των ινών κολλαγόνου και τον σχηματισμό διασυνδέσεων μεταξύ γειτονικών μορίων κολλαγόνου. Σε αντίθεση με τα παρασκευάσματα κολλαγόνου βοοειδών, το αυτόλογο κολλαγόνο δεν προκαλεί ανοσολογικές αντιδράσεις στον λήπτη, αλλά δεν είναι αρκετά αποτελεσματικό ως αναπληρωματικός παράγοντας. Μια σταθερή διόρθωση μπορεί να επιτευχθεί μέσω της τοπικής παραγωγής κολλαγόνου με μεταμόσχευση αυτόλογων ινοβλαστών. Ωστόσο, εντοπίστηκαν ορισμένες δυσκολίες κατά τη μελέτη της αποτελεσματικότητας της μεταμόσχευσης αυτόλογων ινοβλαστών στην κλινική. Στην πρώιμη περίοδο μετά τη μεταμόσχευση ινοβλαστών, το κλινικό αποτέλεσμα ήταν ασθενέστερο σε σύγκριση με αυτό μετά την εισαγωγή κολλαγόνου βοοειδών. Κατά την καλλιέργεια αυτόλογων ινοβλαστών, δεν μπορεί να αποκλειστεί η πιθανότητα μετασχηματισμού φυσιολογικών ινοβλαστών σε παθολογικούς, τους λεγόμενους μυοϊνοβλάστες, που είναι υπεύθυνοι για την ανάπτυξη ίνωσης και σχηματισμού ουλών, όπως αποδεικνύεται από τη συστολή του πηκτώματος κολλαγόνου που προκαλείται από την ειδική αλληλεπίδραση ινοβλαστών και ινιδίων κολλαγόνου. Επιπλέον, μετά από σειριακή διέλευση in vitro, οι ινοβλάστες χάνουν την ικανότητα να συνθέτουν πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας.

Ωστόσο, έχει πλέον αναπτυχθεί πειραματικά μια μέθοδος καλλιέργειας αυτόλογων ανθρώπινων ινοβλαστών που εξαλείφει τις προαναφερθείσες ελλείψεις και δεν οδηγεί σε ογκογενή μετασχηματισμό των φυσιολογικών ινοβλαστών. Οι αυτόλογοι ινοβλάστες που λαμβάνονται με αυτή τη μέθοδο χρησιμοποιούνται για την αποκατάσταση ελαττωμάτων στους μαλακούς ιστούς του προσώπου. Σε μια μελέτη των G. Keller et al. (2000), υποβλήθηκαν σε θεραπεία 20 ασθενείς ηλικίας 37 έως 61 ετών με ρυτίδες και ατροφικές ουλές. Βιοψίες δέρματος (4 mm) από την οπισθοωτιαία περιοχή μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο σε αποστειρωμένους δοκιμαστικούς σωλήνες που περιείχαν 10 ml μέσου καλλιέργειας (μέσο Eagle με αντιβιοτικό, μυκοσηπτικό, πυροσταφυλικό και εμβρυϊκό ορό μοσχαριού). Το υλικό τοποθετήθηκε μέσα σε 3-5 τρυβλία καλλιέργειας διαμέτρου 60 mm και επωάστηκε σε θερμοστάτη με ατμόσφαιρα που περιείχε 5% CO2. Μετά από 1 εβδομάδα, τα κύτταρα αφαιρέθηκαν από τα τρυβλία με θρυψινοποίηση και τοποθετήθηκαν σε φιαλίδια των 25 cm2. Τα κύτταρα εγχύθηκαν σε ασθενείς σε ποσότητα 4 x 107. Ένα σημαντικό και επίμονο κλινικό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε ασθενείς κατά τη διόρθωση των ρινοχειλικών πτυχών, καθώς και σε ασθενείς με ουλές 7 και 12 μήνες μετά την τρίτη μεταμόσχευση αυτόλογων ινοβλαστών. Σύμφωνα με την κυτταρομετρία ροής, οι καλλιεργημένοι ινοβλάστες παρήγαγαν μεγάλη ποσότητα κολλαγόνου τύπου Ι. Μελέτες in vitro έχουν δείξει φυσιολογική συσταλτικότητα των εγχυμένων ινοβλαστών. Δύο μήνες μετά την υποδόρια χορήγηση καλλιεργημένων ινοβλαστών σε δόση 4 x 107 κυττάρων, δεν ανιχνεύθηκαν όγκοι σε γυμνά ποντίκια. Οι εγχυμένοι ινοβλάστες δεν προκάλεσαν ουλές ή διάχυτη ίνωση σε ασθενείς. Σύμφωνα με τον συγγραφέα, οι μεταμοσχευμένοι αυτόλογοι ινοβλάστες είναι ικανοί να παράγουν συνεχώς κολλαγόνο, το οποίο θα παρέχει ένα αισθητικό αποτέλεσμα αναζωογόνησης. Ταυτόχρονα, δεδομένου ότι η διάρκεια ζωής των διαφοροποιημένων κυττάρων είναι περιορισμένη, οι ινοβλάστες που λαμβάνονται από έναν νεαρό ασθενή είναι πιο αποτελεσματικοί από αυτούς που λαμβάνονται από ηλικιωμένους. Στο μέλλον, θεωρείται ότι θα είναι δυνατή η κρυοσυντήρηση μιας καλλιέργειας ινοβλαστών που λαμβάνονται από έναν νεαρό δότη, προκειμένου αργότερα να μεταμοσχευθούν τα δικά του νεαρά κύτταρα σε έναν ηλικιωμένο ασθενή. Συμπερασματικά, δεν είναι απολύτως σωστό να συμπεράνουμε ότι οι αυτόλογοι ινοβλάστες, υπό την προϋπόθεση ότι διατηρούνται λειτουργικά, αποτελούν ιδανικό μέσο για τη διόρθωση ελαττωμάτων των μαλακών ιστών του προσώπου. Ταυτόχρονα, ο ίδιος ο συγγραφέας σημειώνει ότι κατά τη διάρκεια της μελέτης προέκυψαν ορισμένες προβληματικές καταστάσεις που σχετίζονται με τη χρήση του αυτόλογου συστήματος ινοβλαστών-κολλαγόνου. Το κλινικό αποτέλεσμα ήταν συχνά ασθενέστερο από ό,τι κατά τη χρήση κολλαγόνου βοοειδών, γεγονός που προκάλεσε απογοήτευση στους ασθενείς.

Γενικά, τα βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με τις προοπτικές για την κλινική χρήση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων φαίνονται αρκετά αισιόδοξα. Γίνονται προσπάθειες χρήσης αυτόλογων πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων μυελού των οστών για τη θεραπεία εκφυλιστικών βλαβών των αρθρώσεων. Διεξάγονται οι πρώτες κλινικές δοκιμές χρήσης καλλιεργημένων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων στη θεραπεία σύνθετων καταγμάτων των οστών. Τα αυτο- και αλλογενή μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα μυελού των οστών χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία ιστού χόνδρου για μεταμόσχευση στη διόρθωση ελαττωμάτων αρθρικού χόνδρου λόγω τραύματος ή αυτοάνοσων βλαβών. Αναπτύσσονται μέθοδοι για την κλινική χρήση πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων για την εξάλειψη των οστικών ελαττωμάτων σε παιδιά με σοβαρή μορφή ατελούς οστεογένεσης που προκαλείται από μεταλλάξεις στο γονίδιο του κολλαγόνου τύπου Ι. Μετά τη μυελοκαυτηρίαση, στα παιδιά-δέκτες μεταμοσχεύεται μυελός των οστών από υγιείς δότες συμβατούς με HLA, καθώς ο μη κλασματωμένος μυελός των οστών μπορεί να περιέχει επαρκή αριθμό μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων για να αντισταθμίσει ένα σοβαρό οστικό ελάττωμα. Μετά από μεταμόσχευση αλλογενούς μυελού των οστών, αυτά τα παιδιά έχουν δείξει θετικές ιστολογικές αλλαγές στα δοκιδωτά οστά, αύξηση του ρυθμού ανάπτυξης και μείωση της συχνότητας εμφάνισης καταγμάτων οστών. Σε ορισμένες περιπτώσεις, ένα θετικό κλινικό αποτέλεσμα επιτυγχάνεται με τη μεταμόσχευση στενά συγγενούς αλλογενούς μυελού των οστών και οστεοβλαστών. Η μεταμόσχευση MSC χρησιμοποιείται επίσης για τη θεραπεία της συγγενούς ευθραυστότητας των οστών που προκαλείται από ανισορροπία οστεοβλαστών και οστεοκλαστών στον οστικό ιστό. Σε αυτήν την περίπτωση, η αποκατάσταση του σχηματισμού οστού επιτυγχάνεται μέσω χιμαιρισμού της δεξαμενής βλαστικών και προγονικών στρωματικών κυττάρων στον οστικό ιστό των ασθενών.

Η βελτίωση των μεθόδων γενετικής τροποποίησης μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων δοτών με σκοπό τη διόρθωση γενετικών ελαττωμάτων των στρωματικών ιστών συνεχίζεται. Υποτίθεται ότι στο εγγύς μέλλον τα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα θα χρησιμοποιηθούν στη νευρολογία για στοχευμένη χιμαιροποίηση εγκεφαλικών κυττάρων και τη δημιουργία υγιούς ομάδας κυττάρων ικανών να παράγουν ανεπαρκή ένζυμα ή παράγοντες που ευθύνονται για τις κλινικές εκδηλώσεις της νόσου. Η μεταμόσχευση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αποκατάσταση του στρώματος του μυελού των οστών σε ασθενείς με καρκίνο μετά από ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία, και σε συνδυασμό με κύτταρα μυελού των οστών - για την αποκατάσταση της αιμοποίησης. Η ανάπτυξη θεραπείας υποκατάστασης που στοχεύει στην εξάλειψη ελαττωμάτων του μυοσκελετικού συστήματος με τη βοήθεια των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων (MSCs) προωθείται από τις εξελίξεις της μηχανικής στον τομέα του σχεδιασμού βιοϋλικών μήτρας ή βιομιμητικών που σχηματίζουν πλαίσια που αποτελούνται από απογόνους μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων.

Πηγές μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων

Η κύρια πηγή μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων είναι ο μυελός των οστών, του οποίου τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα στο σώμα των θηλαστικών διαφοροποιούνται συνεχώς σε κύτταρα του αίματος και του ανοσοποιητικού συστήματος, ενώ τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα αντιπροσωπεύονται από έναν μικρό πληθυσμό ινοβλαστικών κυττάρων του στρώματος του μυελού των οστών και συμβάλλουν στη διατήρηση της αδιαφοροποίητης κατάστασης των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων. Υπό ορισμένες συνθήκες, τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα διαφοροποιούνται σε κύτταρα χόνδρου και οστικού ιστού. Όταν σπέρνονται σε ένα μέσο καλλιέργειας υπό συνθήκες φύτευσης χαμηλής πυκνότητας, τα μονοπύρηνα στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών σχηματίζουν αποικίες συγκολλητικών κυττάρων, τα οποία, στην πραγματικότητα, είναι ινοβλαστικά πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα. Μερικοί συγγραφείς πιστεύουν ότι τα μη δεσμευμένα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα εναποτίθενται στον μυελό των οστών, τα οποία, λόγω της ικανότητάς τους να αυτοανανέώνονται και του υψηλού δυναμικού διαφοροποίησης, παρέχουν σε όλους τους ιστούς του σώματος μεσεγχυματικούς προδρόμους στρωματικών στοιχείων καθ' όλη τη διάρκεια ζωής του θηλαστικού οργανισμού.

Στον μυελό των οστών, τα στρωματικά κυτταρικά στοιχεία σχηματίζουν ένα δίκτυο που γεμίζει τον χώρο μεταξύ των κολποειδών και του οστικού ιστού. Η περιεκτικότητα των αδρανών MSCs στον μυελό των οστών ενός ενήλικα είναι συγκρίσιμη με την ποσότητα των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων και δεν υπερβαίνει το 0,01-0,001%. Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα που απομονώνονται από τον μυελό των οστών και δεν υποβάλλονται σε καλλιέργεια στερούνται μορίων προσκόλλησης. Τέτοια MSCs δεν εκφράζουν CD34, ICAM, VCAM, κολλαγόνο τύπου Ι και III, CD44 και CD29. Συνεπώς, in vitro, δεν είναι μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα που στερεώνονται στο υπόστρωμα καλλιέργειας, αλλά πιο προηγμένα προγονικά παράγωγα μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων που έχουν ήδη σχηματίσει τα συστατικά του κυτταροσκελετού και της συσκευής υποδοχέα των μορίων κυτταρικής προσκόλλησης. Τα στρωματικά κύτταρα με φαινότυπο CD34 βρίσκονται ακόμη και στο περιφερικό αίμα, αν και στον μυελό των οστών υπάρχουν σημαντικά λιγότερα από αυτά από τα CD34-θετικά μονοπύρηνα κύτταρα. Τα κύτταρα CD34 που απομονώνονται από το αίμα και μεταφέρονται σε καλλιέργεια προσκολλώνται στο υπόστρωμα και σχηματίζουν αποικίες κυττάρων που μοιάζουν με ινοβλάστες.

Είναι γνωστό ότι στην εμβρυϊκή περίοδο η στρωματική βάση όλων των οργάνων και ιστών των θηλαστικών και των ανθρώπων προκύπτει από μια κοινή ομάδα μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων πριν και στο στάδιο της οργανογένεσης. Επομένως, πιστεύεται ότι σε έναν ώριμο οργανισμό η πλειονότητα των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων θα πρέπει να βρίσκεται στον συνδετικό και οστικό ιστό. Έχει διαπιστωθεί ότι το κύριο μέρος των κυτταρικών στοιχείων του στρώματος του χαλαρού συνδετικού και οστικού ιστού αντιπροσωπεύεται από δεσμευμένα προγονικά κύτταρα, τα οποία, ωστόσο, διατηρούν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται και να σχηματίζουν κλώνους in vitro. Όταν τέτοια κύτταρα εισάγονται στη γενική κυκλοφορία του αίματος, περισσότερο από το 20% των μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων εμφυτεύονται μεταξύ των στρωματικών στοιχείων του αιμοποιητικού ιστού και των παρεγχυματικών οργάνων.

Μια πιθανή πηγή μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων είναι ο λιπώδης ιστός, μεταξύ των βλαστοκυττάρων των οποίων έχουν εντοπιστεί πρόδρομοι λιποκυττάρων που έχουν δεσμευτεί σε ποικίλους βαθμούς. Τα λιγότερο ώριμα προγονικά στοιχεία του λιπώδους ιστού είναι τα στρωματο-αγγειακά κύτταρα, τα οποία, όπως τα πολυδύναμα μεσεγχυματικά πρόδρομα κύτταρα του μυελού των οστών, είναι ικανά να διαφοροποιηθούν σε λιποκύτταρα υπό την επίδραση γλυκοκορτικοειδών, ινσουλινοειδούς αυξητικού παράγοντα και ινσουλίνης. Σε καλλιέργεια, τα στρωματο-αγγειακά κύτταρα διαφοροποιούνται σε λιποκύτταρα και χονδροκύτταρα, και στον λιπώδη ιστό μυελού των οστών υπάρχουν κύτταρα που σχηματίζουν λιποκύτταρα και οστεοβλάστες.

Στρωματικά βλαστοκύτταρα έχουν επίσης βρεθεί σε μύες. Στην πρωτογενή καλλιέργεια κυττάρων που απομονώθηκαν από ανθρώπινο σκελετικό μυ, ανιχνεύονται αστεροειδή κύτταρα και πολυπύρηνοι μυοσωλήνες. Παρουσία ορού αλόγου, τα αστεροειδή κύτταρα πολλαπλασιάζονται in vitro χωρίς σημάδια κυτταροδιαφοροποίησης και μετά την προσθήκη δεξαμεθαζόνης στο θρεπτικό μέσο, η διαφοροποίησή τους χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση κυτταρικών στοιχείων με τον φαινότυπο των σκελετικών και λείων μυϊκών κυττάρων, των οστών, των χόνδρων και του λιπώδους ιστού. Επομένως, στον ανθρώπινο μυϊκό ιστό υπάρχουν τόσο δεσμευμένα όσο και μη δεσμευμένα πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα. Έχει αποδειχθεί ότι ο πληθυσμός των προγονικών κυττάρων που υπάρχουν στον σκελετικό μυ προέρχεται από μη δεσμευμένα πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα του μυελού των οστών και διαφέρει από τα μυογενή δορυφορικά κύτταρα.

Προσκολλητικά αστεροειδή κύτταρα που αντιστοιχούν σε πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα σε δυναμικό διαφοροποίησης βρέθηκαν επίσης στο μυοκάρδιο νεογέννητων αρουραίων, καθώς υπό την επίδραση της δεξαμεθαζόνης διαφοροποιούνται σε λιποκύτταρα, οστεοβλάστες, χονδροκύτταρα, λεία μυϊκά κύτταρα, μυοσωλήνες σκελετικών μυών και καρδιομυοκύτταρα. Αποδείχθηκε ότι τα αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα (περικύτταρα) είναι παράγωγα αδιαφοροποίητων περιαγγειακών πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων. Σε καλλιέργεια, τα περιαγγειακά μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα εκφράζουν α-ακτίνη λείων μυών και υποδοχέα αυξητικού παράγοντα που προέρχεται από αιμοπετάλια και είναι ικανά να διαφοροποιηθούν τουλάχιστον σε λεία μυϊκά κύτταρα.

Ιδιαίτερη θέση, από την άποψη των αποθεμάτων των στελεχών, κατέχει ο χόνδρινος ιστός, του οποίου το εξαιρετικά χαμηλό επανορθωτικό δυναμικό πιστεύεται ότι οφείλεται σε ανεπάρκεια πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων ή παραγόντων διαφοροποίησης και ανάπτυξης. Υποτίθεται ότι τα πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα που έχουν δεσμευτεί για χονδρογένεση και οστεογένεση εισέρχονται στον χόνδρινο ιστό από άλλες πηγές ιστών.

Η ιστική προέλευση και οι συνθήκες δέσμευσης των μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων στους τένοντες δεν έχουν επίσης τεκμηριωθεί. Πειραματικές παρατηρήσεις δείχνουν ότι στην πρώιμη μεταγεννητική περίοδο, τα κύτταρα του Αχίλλειου τένοντα κουνελιού σε πρωτογενείς καλλιέργειες και κατά την πρώτη διέλευση διατηρούν την έκφραση κολλαγόνου και ντεκορίνης τύπου Ι, αλλά με περαιτέρω καλλιέργεια χάνουν τους δείκτες διαφοροποίησης των τενοκυττάρων.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι δεν έχει ακόμη δοθεί απάντηση στο ερώτημα εάν τα πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα που εντοπίζονται σε διάφορους ιστούς είναι στην πραγματικότητα συνεχώς παρόντα στο στρώμα τους ή εάν η ιστική δεξαμενή μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων αναπληρώνεται από τη μετανάστευση στρωματικών βλαστικών κυττάρων μυελού των οστών.

Εκτός από τον μυελό των οστών και άλλες ζώνες μεσεγχυματικού ιστού ενός ενήλικου οργανισμού, το αίμα του ομφάλιου λώρου μπορεί να αποτελέσει μια άλλη πηγή MSCs. Έχει αποδειχθεί ότι το αίμα της φλέβας του ομφάλιου λώρου περιέχει κύτταρα που έχουν παρόμοια μορφολογικά και αντιγονικά χαρακτηριστικά με πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα, είναι ικανά για προσκόλληση και δεν είναι κατώτερα από τα πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα μυελού των οστών σε δυναμικό διαφοροποίησης. Σε καλλιέργειες μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων ομφάλιου λώρου, βρέθηκαν 5 έως 10% μη δεσμευμένων πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων. Αποδείχθηκε ότι ο αριθμός τους στο αίμα του ομφάλιου λώρου είναι αντιστρόφως ανάλογος με την ηλικία κύησης, γεγονός που υποδηλώνει έμμεσα τη μετανάστευση πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων σε διάφορους ιστούς κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Έχουν εμφανιστεί οι πρώτες πληροφορίες σχετικά με την κλινική χρήση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων που απομονώθηκαν από αίμα ομφάλιου λώρου, καθώς και εκείνων που λήφθηκαν από εμβρυϊκό βιοϋλικό, η οποία βασίζεται στη γνωστή ικανότητα των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων να ενσωματώνονται, να εμφυτεύονται και να λειτουργούν στα όργανα και τα συστήματα ιστών ενήλικων ληπτών.

Αναζήτηση νέων πηγών μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων

Η χρήση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων εμβρυϊκής προέλευσης, καθώς και άλλων εμβρυϊκών κυττάρων, δημιουργεί μια σειρά από ηθικά, νομικά, δικαστικά και νομοθετικά προβλήματα. Συνεπώς, η αναζήτηση εξωεμβρυϊκού κυτταρικού υλικού από δότες συνεχίζεται. Μια προσπάθεια κλινικής χρήσης ινοβλαστών ανθρώπινου δέρματος ήταν ανεπιτυχής, κάτι που προκαθορίστηκε όχι μόνο από την υψηλή οικονομική δυνατότητα της τεχνολογίας, αλλά και από την ταχεία διαφοροποίηση των ινοβλαστών σε ινοκύτταρα, τα οποία έχουν σημαντικά χαμηλότερο δυναμικό πολλαπλασιασμού και παράγουν περιορισμένο αριθμό αυξητικών παραγόντων. Η περαιτέρω πρόοδος στη μελέτη της βιολογίας των MSC και των πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων του μυελού των οστών μας επέτρεψε να αναπτύξουμε μια στρατηγική για την κλινική χρήση αυτόλογων μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων. Η τεχνολογία της απομόνωσης, της καλλιέργειάς τους, της ex vivo αναπαραγωγής και της στοχευμένης διαφοροποίησής τους απαιτούσε, πρώτα απ 'όλα, τη μελέτη του φάσματος των μοριακών δεικτών των MSC. Η ανάλυσή τους έδειξε ότι οι πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινου οστικού ιστού περιέχουν διάφορους τύπους πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων. Ο φαινότυπος των προοστεοβλαστών ανιχνεύθηκε σε κύτταρα που εκφράζουν τον δείκτη των στρωματικών προγονικών κυττάρων STRO-1, αλλά δεν φέρουν τον δείκτη οστεοβλαστών - αλκαλική φωσφατάση. Τέτοια κύτταρα χαρακτηρίζονται από χαμηλή ικανότητα σχηματισμού μεταλλοποιημένης οστικής μήτρας, καθώς και από την απουσία έκφρασης υποδοχέα οστεοποντίνης και παραθυρεοειδούς ορμόνης. Παράγωγα των STRO-1-θετικών κυττάρων που δεν εκφράζουν αλκαλική φωσφατάση αντιπροσωπεύονται από ενδιάμεσα και πλήρως διαφοροποιημένους οστεοβλάστες. Διαπιστώθηκε ότι τα κυτταρικά στοιχεία των κλωνοποιημένων σειρών STRO-1-θετικών ανθρώπινων δοκιδωτών οστικών κυττάρων είναι ικανά να διαφοροποιηθούν σε ώριμα οστεοκύτταρα και λιποκύτταρα. Η κατεύθυνση διαφοροποίησης αυτών των κυττάρων εξαρτάται από την επίδραση των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, των προφλεγμονωδών κυτοκινών - IL-1b και του παράγοντα νέκρωσης όγκων α (TNF-a), καθώς και του αντιφλεγμονώδους και ανοσοκατασταλτικού TGF-b.

Αργότερα διαπιστώθηκε ότι τα πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα δεν έχουν έναν συγκεκριμένο φαινότυπο που είναι εγγενής μόνο σε αυτά, αλλά εκφράζουν ένα σύμπλεγμα δεικτών χαρακτηριστικών των μεσεγχυματικών, ενδοθηλιακών, επιθηλιακών και μυϊκών κυττάρων απουσία έκφρασης ανοσοφαινοτυπικών αντιγόνων αιμοποιητικών κυττάρων - CD45, CD34 και CD14. Επιπλέον, τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα παράγουν συστατικά και επαγώγιμα αιμοποιητικούς και μη αιμοποιητικούς αυξητικούς παράγοντες, ιντερλευκίνες και χημειοκίνες, και υποδοχείς για ορισμένες κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες εκφράζονται σε πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα. Αδρανή, ή ηρεμούντα, κύτταρα με ανοσοφαινότυπο σχεδόν πανομοιότυπο με το αντιγονικό προφίλ των μη επεξεργασμένων με 5-φθοροουρακίλη πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων έχουν βρεθεί μεταξύ των κυττάρων της στρωματικής μήτρας του ανθρώπινου σώματος - και τα δύο κύτταρα εκφράζουν CD117, το οποίο σηματοδοτεί τα «ενήλικα» βλαστοκύτταρα.

Έτσι, δεν έχει ακόμη εντοπιστεί ένας κυτταρικός δείκτης μοναδικός για τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα. Υποτίθεται ότι τα ηρεμιστικά κύτταρα αντιπροσωπεύουν έναν πληθυσμό μη δεσμευμένων πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων, καθώς δεν εκφράζουν δείκτες κυττάρων δεσμευμένων στην οστεογένεση (Cbfa-1) ή την αδιπογένεση (PPAR-y-2). Η παρατεταμένη έκθεση αργά πολλαπλασιαζόμενων ηρεμιστικών κυττάρων σε εμβρυϊκό ορό βοοειδών οδηγεί στο σχηματισμό τελικώς διαφοροποιούμενων δεσμευμένων προγονικών κυττάρων που χαρακτηρίζονται από ταχεία ανάπτυξη. Η κλωνική επέκταση τέτοιων μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων υποστηρίζεται από τον FGF2. Φαίνεται ότι το γονιδίωμα των στρωματικών βλαστοκυττάρων είναι αρκετά σφιχτά «κλειστό». Υπάρχουν αναφορές για την απουσία αυθόρμητης διαφοροποίησης στα MSCs - χωρίς ειδικές συνθήκες για δέσμευση, δεν μετασχηματίζονται ούτε καν σε κύτταρα της μεσεγχυματικής γενεαλογίας.

Για τη μελέτη της πληθυσμιακής δομής των παραγώγων μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων, διεξάγεται αναζήτηση πρωτεϊνών δεικτών διαφοροποίησης σε στρωματικές κυτταρικές σειρές και σε πρωτογενείς καλλιέργειες. Η κλωνική ανάλυση in vitro κυττάρων που σχηματίζουν αποικίες μυελού των οστών έδειξε ότι ο EGF αυξάνει το μέσο μέγεθος αποικίας και μειώνει την κλωνική έκφραση της αλκαλικής φωσφατάσης όταν εφαρμόζεται σε πρωτογενείς καλλιέργειες, ενώ η προσθήκη υδροκορτιζόνης ενεργοποιεί την έκφραση της αλκαλικής φωσφατάσης, η οποία είναι δείκτης της οστεογενετικής κατεύθυνσης της διαφοροποίησης των MSC. Τα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του STRO-1 κατέστησαν δυνατό τον διαχωρισμό και τη μελέτη του πληθυσμού των STRO-1-θετικών προσκολλητικών κυττάρων σε ένα ετερογενές σύστημα καλλιεργειών Dexter. Έχει προσδιοριστεί ένα φάσμα κυτοκινών που ρυθμίζουν όχι μόνο τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών και λεμφοειδών κυττάρων, αλλά συμμετέχουν επίσης στον σχηματισμό, τον σχηματισμό και την απορρόφηση των σκελετικών ιστών μέσω παρα-, αυτο- και ενδοκρινικών μηχανισμών. Η απελευθέρωση δευτερογενών αγγελιοφόρων όπως cAMP, διακυλογλυκερόλη, τριφωσφορική ινοσιτόλη και Ca2+ που προκαλείται από υποδοχείς χρησιμοποιείται επίσης για την ανάλυση δεικτών διαφόρων κατηγοριών κυττάρων στρωματικού ιστού που εκφράζουν τους αντίστοιχους υποδοχείς. Η χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων ως δεικτών κατέστησε δυνατή την αναγνώριση της συμμετοχής των δικτυωτών κυττάρων του στρώματος των λεμφοειδών οργάνων στις ζώνες που εξαρτώνται από τα Τ και Β υποδοχείς.

Για κάποιο χρονικό διάστημα, οι επιστημονικές συζητήσεις συνεχίστηκαν γύρω από το ζήτημα της πιθανότητας προέλευσης των MSC από ένα αιμοποιητικό βλαστοκύτταρο. Πράγματι, όταν εναιωρήματα κυττάρων μυελού των οστών εμφυτεύονται σε μονοστοιβάδες, αναπτύσσονται σε αυτές διακριτές αποικίες ινοβλαστών. Ωστόσο, αποδείχθηκε ότι η παρουσία προδρόμων αποικιών ινοβλαστών και διαφόρων βλαστών διαφοροποίησης αιμοποιητικού ιστού στον μυελό των οστών δεν αποτελεί απόδειξη της κοινής τους προέλευσης από ένα αιμοποιητικό βλαστοκύτταρο. Χρησιμοποιώντας διακριτική ανάλυση βλαστοκυττάρων μυελού των οστών, διαπιστώθηκε ότι το μικροπεριβάλλον κατά τη διάρκεια της ετεροτοπικής μεταμόσχευσης μυελού των οστών δεν μεταφέρεται από τα αιμοποιητικά κύτταρα, γεγονός που αποδεικνύει την ύπαρξη ενός πληθυσμού MSC στον μυελό των οστών που είναι ιστογενετικά ανεξάρτητος από τα αιμοποιητικά κύτταρα.

Επιπλέον, η μέθοδος επιλεκτικής κλωνοποίησης κατέστησε δυνατή την αναγνώριση μιας νέας κατηγορίας στρωματικών προγονικών κυττάρων σε μονοστοιβάδες καλλιέργειες κυττάρων μυελού των οστών, τον προσδιορισμό του αριθμού τους και τη μελέτη των ιδιοτήτων τους, των πολλαπλασιαστικών και διαφοροποιητικών δυνατοτήτων τους. Αποδείχθηκε ότι τα στρωματικά ινοβλαστικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται in vitro και σχηματίζουν διπλοειδείς αποικίες, οι οποίες, όταν μεταμοσχεύονται πίσω στο σώμα, προβλέπουν τον σχηματισμό νέων αιμοποιητικών οργάνων. Τα αποτελέσματα της μελέτης μεμονωμένων κλώνων δείχνουν ότι μεταξύ των στρωματικών προγονικών κυττάρων υπάρχει ένας πληθυσμός κυττάρων που, με το πολλαπλασιαστικό και διαφοροποιητικό τους δυναμικό, μπορούν να διεκδικήσουν τον ρόλο των βλαστικών κυττάρων του στρωματικού ιστού, ιστογενετικά ανεξάρτητα από τα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα. Τα κύτταρα αυτού του πληθυσμού χαρακτηρίζονται από αυτοσυντηρούμενη ανάπτυξη και διαφοροποιούνται σε προγονικά κυτταρικά στοιχεία οστού, χόνδρου και δικτυωτού ιστού του μυελού των οστών.

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα αποτελέσματα των μελετών του R. Chailakhyan και των συν-συγγραφέων (1997-2001), οι οποίοι καλλιέργησαν στρωματικά προγονικά κύτταρα μυελού των οστών από κουνέλια, ινδικά χοιρίδια και ποντίκια στο θρεπτικό μέσο a-MEM με την προσθήκη εμβρυϊκού ορού μοσχαριού. Οι συγγραφείς πραγματοποίησαν την εκφύτευση με αρχική πυκνότητα 2-4 x 103 κύτταρα μυελού των οστών ανά 1 cm2. Ομόλογα ή ετερόλογα κύτταρα μυελού των οστών απενεργοποιημένα με ακτινοβολία χρησιμοποιήθηκαν ως τροφοδότης σε δόση που διατήρησε το τροφικό αποτέλεσμα αλλά μπλόκαρε πλήρως τον πολλαπλασιασμό τους. Πρωτογενείς διακριτές αποικίες ινοβλαστών ηλικίας δύο εβδομάδων υποβλήθηκαν σε θρυψινοποίηση για να ληφθούν μονοκλωνικά στελέχη. Αποδείξεις για την κλωνική προέλευση των αποικιών ελήφθησαν χρησιμοποιώντας έναν χρωμοσωμικό δείκτη σε μικτές καλλιέργειες μυελού των οστών αρσενικών και θηλυκών ινδικών χοιριδίων, φωτογραφία time-lapse ζωντανών καλλιεργειών και σε μικτές καλλιέργειες συγγενικού μυελού των οστών ποντικών CBA και CBAT6T6. Η μεταμόσχευση εναιωρήματος πρόσφατα απομονωμένων κυττάρων μυελού των οστών ή in vitro καλλιεργημένων στρωματικών ινοβλαστών κάτω από την νεφρική κάψουλα πραγματοποιήθηκε σε πορώδη ικριώματα ivalon ή ζελατίνης, καθώς και σε αδρανοποιημένο σπογγώδες οστικό πλέγμα κουνελιού. Για τη μεταμόσχευση κλώνων σε οστικό έλυτρο, τα μηριαία οστάρια ινδικού χοιριδίου καθαρίστηκαν από μαλακούς ιστούς και περιόστεο, οι επιφύσεις αφαιρέθηκαν και ο μυελός των οστών πλύθηκε σχολαστικά. Το οστό κόπηκε σε θραύσματα (3-5 mm), ξηράνθηκε και ακτινοβολήθηκε σε δόση 60 Gy. Μεμονωμένες αποικίες ινοβλαστών τοποθετήθηκαν σε οστικά έλυτρα και εμφυτεύτηκαν ενδομυϊκά. Για ενδοπεριτοναϊκή μεταμόσχευση στρωματικών ινοβλαστών που αναπτύχθηκαν in vitro, χρησιμοποιήθηκαν θάλαμοι διάχυσης τύπου A (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) και O (V=0,15 cm3, h=2 mm).

Κατά τη μελέτη της δυναμικής ανάπτυξης των κλωνικών στελεχών, οι R. Chailakhyan et al. (2001) διαπίστωσαν ότι τα μεμονωμένα κύτταρα που σχηματίζουν αποικίες ινοβλαστών, καθώς και οι απόγονοί τους, έχουν τεράστιο πολλαπλασιαστικό δυναμικό. Μέχρι το 10ο πέρασμα, ο αριθμός των ινοβλαστών σε ορισμένα στελέχη ήταν 1,2-7,2 x 109 ^{κύτταρα}. Κατά την ανάπτυξή τους, πραγματοποίησαν έως και 31-34 διπλασιασμούς κυττάρων. Σε αυτήν την περίπτωση, η ετεροτοπική μεταμόσχευση στελεχών που προέρχονται από μυελό των οστών και σχηματίστηκαν από στρωματικούς προδρόμους αρκετών δεκάδων κλώνων είχε ως αποτέλεσμα τη μεταφορά του μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών και τον σχηματισμό ενός νέου αιμοποιητικού οργάνου στη ζώνη μεταμόσχευσης. Οι συγγραφείς έθεσαν το ερώτημα εάν οι μεμονωμένοι κλώνοι είναι ικανοί να μεταφέρουν το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών των στρωματικών κυττάρων ή εάν απαιτείται η συνεργασία αρκετών διαφορετικών κλωνογενών στρωματικών προδρόμων για αυτό; Και εάν οι μεμονωμένοι κλώνοι είναι ικανοί να μεταφέρουν το μικροπεριβάλλον, θα είναι πλήρες και για τους τρεις αιμοποιητικούς βλαστούς ή μήπως διαφορετικοί κλώνοι παρέχουν τον σχηματισμό του μικροπεριβάλλοντος για διαφορετικούς αιμοποιητικούς βλαστούς; Για την επίλυση αυτών των προβλημάτων, αναπτύχθηκε μια τεχνολογία για την καλλιέργεια στρωματικών προγονικών κυττάρων σε ένα πήκτωμα κολλαγόνου, επιτρέποντας την απομάκρυνση των αναπτυγμένων αποικιών ινοβλαστών από την επιφάνεια για επακόλουθη ετεροτοπική μεταμόσχευση. Μεμονωμένοι κλώνοι στρωματικών ινοβλαστών που αναπτύχθηκαν από κύτταρα μυελού των οστών ποντικών CBA και ινδικών χοιριδίων αφαιρέθηκαν μαζί με ένα θραύσμα της επικάλυψης πηκτής και μεταμοσχεύθηκαν ετεροτοπικά - κάτω από την νεφρική κάψουλα συγγενικών ποντικών ή στον κοιλιακό μυ αυτόλογων ινδικών χοιριδίων. Όταν μεταμοσχεύθηκαν στον μυ, οι αποικίες στο πήκτωμα τοποθετήθηκαν σε οστικά έλυτρα.

Οι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι 50-90 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση αποικιών ινοβλαστών μυελού των οστών, παρατηρήθηκε ανάπτυξη οστού ή οστικού και αιμοποιητικού ιστού στη ζώνη μεταμόσχευσης στο 20% των περιπτώσεων. Στο 5% των ζώων-δεκτών, οι σχηματισμένες εστίες οστικού ιστού περιείχαν μια κοιλότητα γεμάτη με μυελό των οστών. Μέσα στους οστικούς κυλίνδρους, τέτοιες εστίες είχαν στρογγυλεμένο σχήμα και μια κάψουλα κατασκευασμένη από οστικό ιστό με οστεοκύτταρα και ένα καλά αναπτυγμένο οστεοβλαστικό στρώμα. Η κοιλότητα του μυελού των οστών περιείχε δικτυωτό ιστό με μυελοειδή και ερυθροειδή κύτταρα, η αναλογική σχέση των οποίων δεν διέφερε από αυτή στον φυσιολογικό μυελό των οστών. Στο νεφρό, το μόσχευμα ήταν ένα τυπικό όργανο μυελού των οστών που σχηματίστηκε κατά τη μεταμόσχευση φυσικού μυελού των οστών, με την οστική κάψουλα να καλύπτει την κοιλότητα του μυελού των οστών μόνο από την πλευρά της νεφρικής κάψουλας. Ο αιμοποιητικός ιστός περιελάμβανε μυελοειδή, ερυθροειδή και μεγακαρυοκυτταρικά στοιχεία. Το στρώμα της κοιλότητας του μυελού των οστών είχε ένα καλά αναπτυγμένο σύστημα κόλπων και περιείχε τυπικά λιποκύτταρα. Ταυτόχρονα, οστικός ιστός χωρίς σημάδια αιμοποίησης βρέθηκε στη ζώνη μεταμόσχευσης ορισμένων αποικιών κάτω από την νεφρική κάψουλα. Η μελέτη των πολλαπλασιαστικών και διαφοροποιητικών δυνατοτήτων μεμονωμένων κλώνων συνεχίστηκε σε μονοκλωνικά στελέχη μυελού των οστών κουνελιών, τα κύτταρα των οποίων επαναιωρήθηκαν σε θρεπτικό μέσο και σε ξεχωριστό σφουγγάρι ivalon με μάζα 1-2 mg μεταμοσχεύθηκαν κάτω από την νεφρική κάψουλα ενός δότη μυελού των οστών κουνελιού. Κύτταρα 21 μονοκλωνικών στελεχών υποβλήθηκαν σε τέτοια αυτομεταμόσχευση. Τα αποτελέσματα ελήφθησαν υπόψη μετά από 2-3 μήνες. Οι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι σε 14% των περιπτώσεων, τα μεταμοσχευμένα μονοκλωνικά στελέχη σχημάτισαν ένα όργανο μυελού των οστών που αποτελείται από οστικό ιστό και μια κοιλότητα μυελού των οστών γεμάτη με αιμοποιητικά κύτταρα. Σε 33% των περιπτώσεων, τα μεταμοσχευμένα στελέχη σχημάτισαν ένα συμπαγές οστό ποικίλου μεγέθους με οστεοκύτταρα ενσωματωμένα στις κοιλότητες και ένα ανεπτυγμένο οστεοβλαστικό στρώμα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, δικτυωτός ιστός χωρίς οστό ή αιμοποιητικά στοιχεία αναπτύχθηκε στους σπόγγους με μεταμοσχευμένους κλώνους. Μερικές φορές, σχηματίστηκε δικτυωτό στρώμα με ένα καλά ανεπτυγμένο δίκτυο ημιτονοειδών, αλλά όχι κατοικημένο με αιμοποιητικά κύτταρα. Έτσι, τα αποτελέσματα που ελήφθησαν ήταν παρόμοια με τα δεδομένα που ελήφθησαν κατά τη μεταμόσχευση κλώνων σε γέλη κολλαγόνου. Ωστόσο, εάν η μεταμόσχευση κλώνων που αναπτύχθηκαν σε υπόστρωμα είχε ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό ιστού μυελού των οστών στο 5% των περιπτώσεων, οστικού ιστού στο 15% και δικτυωτού ιστού στο 80% των περιπτώσεων, τότε με τη μεταμόσχευση μονοκλωνικών στελεχών, ο σχηματισμός στοιχείων μυελού των οστών παρατηρήθηκε στο 14% των περιπτώσεων, οστικού ιστού στο 53% και δικτυωτού ιστού στο 53% των περιπτώσεων. Σύμφωνα με τους συγγραφείς, αυτό δείχνει ότι οι συνθήκες για την εφαρμογή του πολλαπλασιαστικού και διαφοροποιητικού δυναμικού των στρωματικών ινοβλαστών κατά τη μεταμόσχευση σε πορώδη ικριώματα ήταν πιο βέλτιστες από ό,τι κατά τη μεταμόσχευση σε οστικά έλυτρα και σε υπόστρωμα κολλαγόνου.Είναι πιθανό ότι η χρήση πιο προηγμένων μεθόδων καλλιέργειας και αντίστροφης μεταμόσχευσης κλώνων μπορεί να βελτιώσει τις συνθήκες για την υλοποίηση του δυναμικού διαφοροποίησής τους από τους κλώνους και να αλλάξει αυτές τις αναλογίες. Με τον ένα ή τον άλλο τρόπο, αλλά η κύρια σημασία των μελετών που διεξήχθησαν είναι ότι ορισμένοι κλώνοι στρωματικών κυττάρων είναι ικανοί να σχηματίζουν οστικό ιστό και ταυτόχρονα να παρέχουν ένα στρωματικό αιματοποιητικό μικροπεριβάλλον για τρία βλαστάρια αιματοποίησης μυελού των οστών ταυτόχρονα: ερυθροειδή, μυελοειδή και μεγακαρυοκυτταρικά, δημιουργώντας αρκετά μεγάλες πλατφόρμες αιματοποιητικού ιστού και κάποια οστική μάζα.

Στη συνέχεια, οι συγγραφείς ασχολήθηκαν με το ζήτημα της ικανότητας των μεμονωμένων κλωνογενών στρωματικών προγονικών κυττάρων να υποβάλλονται σε αυτούς τους τύπους κυτταρικής διαφοροποίησης σε ένα κλειστό σύστημα θαλάμων διάχυσης. Επιπλέον, ήταν απαραίτητο να προσδιοριστεί εάν οι μεμονωμένοι κλώνοι διαθέτουν πολυδυναμικότητα ή εάν η εκδήλωση δυναμικού διαφοροποίησης απαιτεί συνεργατική αλληλεπίδραση αρκετών κλώνων με ένα σταθερό χαρακτηριστικό κυτταροδιαφοροποίησης, οι διαφορετικές αναλογίες των οποίων καθορίζουν τον προτιμησιακό σχηματισμό οστικού, δικτυωτού ή χόνδρινου ιστού. Συνδυάζοντας δύο μεθοδολογικές προσεγγίσεις - τη λήψη μονοκλωνικών στελεχών στρωματικών προγονικών κυττάρων μυελού των οστών και τη μεταμόσχευσή τους σε θαλάμους διάχυσης - ο R. Chailakhyan και οι συν-συγγραφείς (2001) έλαβαν αποτελέσματα που τους επέτρεψαν να έρθουν πιο κοντά στην κατανόηση της δομικής οργάνωσης του στρώματος του μυελού των οστών. Η μεταμόσχευση μονοκλωνικών στελεχών στρωματικών προγονικών κυττάρων σε θαλάμους τύπου Ο είχε ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό τόσο οστικού όσο και χόνδρινου ιστού, υποδεικνύοντας την ικανότητα των απογόνων ενός μόνο στρωματικού κυττάρου που σχηματίζει αποικίες να σχηματίζουν ταυτόχρονα οστικό και χόνδρινο ιστό. Η υπόθεση ότι ο οστικός και ο χόνδρινος ιστός προέρχονται από ένα κοινό στρωματικό προγονικό κύτταρο έχει επανειλημμένα προταθεί. Ωστόσο, αυτή η υπόθεση δεν είχε σωστή πειραματική επιβεβαίωση. Ο σχηματισμός οστού και χόνδρου σε θαλάμους διάχυσης ήταν η απαραίτητη απόδειξη της ύπαρξης ενός κοινού προγονικού κυττάρου για αυτούς τους δύο τύπους ιστού μεταξύ των στρωματικών βλαστοκυττάρων του μυελού των οστών.

Στη συνέχεια, 29 κλωνικά στελέχη των δεύτερων-τρίτων διελεύσεων που ελήφθησαν από πρωτογενείς καλλιέργειες μυελού των οστών κουνελιού τοποθετήθηκαν σε θαλάμους διάχυσης και εμφυτεύτηκαν ενδοπεριτοναϊκά σε ομόλογα ζώα. Οι μελέτες έδειξαν ότι το 45% των μονοκλωνικών στελεχών μυελού των οστών διαθέτουν οστεογενετικό δυναμικό. Εννέα θάλαμοι περιείχαν αποκλειστικά δικτυωτό ιστό, αλλά υπήρχε μαζί με οστικό και χόνδρινο ιστό σε 13 ακόμη θαλάμους, οι οποίοι αποτελούσαν το 76% όλων των στελεχών. Στους θαλάμους τύπου Ο, όπου ήταν δυνατή η διαφοροποίηση τόσο του οστικού όσο και του χόνδρινου ιστού, μελετήθηκαν 16 στελέχη. Σε τέσσερις θαλάμους (25%) σχηματίστηκε τόσο οστεϊκός όσο και χόνδρινος ιστός. Πρέπει να σημειωθεί για άλλη μια φορά ότι στις μελέτες των R. Chailakhyan et al. (2001), τα μεμονωμένα προγονικά κύτταρα υπέστησαν 31 έως 34 διπλασιασμούς εντός ενός κυτταρικού στελέχους και οι απόγονοί τους αποτελούνταν από 0,9-2,0 x 109 ^{κύτταρα}. Ο αριθμός των μιτώσεων που υπέστησαν τα προγονικά κύτταρα των πολυκλωνικών στελεχών ήταν ουσιαστικά πανομοιότυπος με αυτόν των μονοκλωνικών στελεχών. Ο ρυθμός ανάπτυξης των πολυκλωνικών στελεχών, ειδικά στην πρώτη φάση του σχηματισμού τους, εξαρτιόταν σε σημαντικό βαθμό από τον αριθμό των αποικιών που χρησιμοποιήθηκαν για την έναρξη των στελεχών. Τα διπλοειδή στελέχη ανθρώπινων εμβρυϊκών ινοβλαστών (WI-38), όταν επανακλωνοποιήθηκαν στα επίπεδα διπλασιασμού 12-15, σχημάτισαν επίσης αποικίες που διέφεραν σε διάμετρο και περιεκτικότητα σε κύτταρα. Οι μεγάλες αποικίες που περιείχαν περισσότερα από 103 κύτταρα αποτελούσαν μόνο 5-10%. Με την αύξηση του αριθμού των διαιρέσεων, το ποσοστό των μεγάλων αποικιών μειώθηκε. Τα μονοκλωνικά και πολυκλωνικά στελέχη στρωματικών ινοβλαστών μυελού των οστών διατήρησαν ένα διπλοειδές σύνολο χρωμοσωμάτων μετά από 20 ή περισσότερους διπλασιασμούς και η τάση ανάπτυξής τους ήταν συγκρίσιμη με τη δυναμική ανάπτυξης διπλοειδών στελεχών εμβρυϊκών ινοβλαστών. Η ανάλυση του δυναμικού διαφοροποίησης μεμονωμένων στρωματικών προγονικών κυττάρων μυελού των οστών, που πραγματοποιήθηκε με μεταμόσχευση μονοκλωνικών στελεχών σε θαλάμους διάχυσης, έδειξε ότι τα μισά από αυτά ήταν οστεογενή. Οι μεγάλες αποικίες αντιπροσώπευαν το 10% του συνολικού τους αριθμού. Συνεπώς, ο αριθμός των οστεογενών κυττάρων που σχηματίζουν αποικίες αντιστοιχούσε σε περίπου 5% του συνολικού πληθυσμού τους. Η συνολική μάζα των οστεογενών προγονικών κυττάρων που προσδιορίστηκαν από τους συγγραφείς περιελάμβανε κύτταρα ικανά να σχηματίζουν ταυτόχρονα οστικό και χόνδρινο ιστό. Επιπλέον, διαπιστώθηκε για πρώτη φορά ότι αυτοί οι δύο τύποι ιστού σε έναν ενήλικο οργανισμό έχουν ένα κοινό προγονικό κύτταρο: το 25% των δοκιμασμένων κλώνων δημιουργήθηκαν από τέτοια κύτταρα και ο αριθμός τους στον συνολικό πληθυσμό των προγονικών κυττάρων ήταν τουλάχιστον 2,5%.

Έτσι, η ετεροτοπική μεταμόσχευση μεμονωμένων κλώνων ινοβλαστών μυελού των οστών αποκάλυψε νέες πτυχές της δομικής οργάνωσης του πληθυσμού των μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων. Έχουν βρεθεί στρωματικά προγονικά κύτταρα που είναι ικανά να μεταφέρουν ένα συγκεκριμένο μικροπεριβάλλον για όλα τα αιμοποιητικά βλαστάρια ταυτόχρονα, ο αριθμός των οποίων μεταξύ των μεγάλων κλώνων που μελετήθηκαν σε διαφορετικά μοντέλα κυμαίνεται από 5 έως 15% (0,5-1,5% του συνολικού αριθμού των προγονικών κυττάρων που ανιχνεύθηκαν). Μαζί με τους κλώνους που μεταφέρουν το πλήρες μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών, υπάρχουν προγονικά κύτταρα που προσδιορίζονται μόνο στην οστεογένεση, τα οποία, όταν μεταφέρονται σε ανοιχτό σύστημα, σχηματίζουν οστικό ιστό που δεν υποστηρίζει την ανάπτυξη της αιμοποίησης. Ο αριθμός τους από τον συνολικό αριθμό των προγονικών κυττάρων είναι 1,5-3%. Μερικά από αυτά τα κύτταρα είναι ικανά να σχηματίζουν οστικό ιστό με περιορισμένη περίοδο αυτοσυντήρησης. Κατά συνέπεια, ο πληθυσμός των στρωματικών προγονικών κυττάρων είναι ετερογενής στο δυναμικό διαφοροποίησής του. Μεταξύ αυτών, υπάρχει μια κατηγορία κυττάρων που ισχυρίζονται ότι είναι στρωματικά βλαστοκύτταρα, ικανά να διαφοροποιούνται και στις τρεις κατευθύνσεις που χαρακτηρίζουν τον στρωματικό ιστό του μυελού των οστών, σχηματίζοντας οστό, χόνδρο και δικτυωτό ιστό. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται μας επιτρέπουν να ελπίζουμε ότι, χρησιμοποιώντας διάφορους κυτταρικούς δείκτες, θα είναι δυνατό να προσδιοριστεί η συμβολή κάθε τύπου στρωματικών κυττάρων στην οργάνωση ενός συγκεκριμένου μικροπεριβάλλοντος και στην υποστήριξη της αιματοποίησης σε καλλιέργειες Dexter.

Χαρακτηριστικά των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων

Τα τελευταία χρόνια, έχει διαπιστωθεί ότι σε στατικές καλλιέργειες μυελού των οστών, τα πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα αντιπροσωπεύονται από έναν περιορισμένο πληθυσμό μικρών ακοκκιωδών κυττάρων (κύτταρα RS-1) που χαρακτηρίζονται από χαμηλή ικανότητα σχηματισμού αποικιών και απουσία έκφρασης του αντιγόνου Ki-67, ειδικού για τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. Οι αντιγονικές παράμετροι των αδρανών κυττάρων RS-1 διαφέρουν από το φάσμα των αντιγόνων των ταχέως πολλαπλασιαζόμενων δεσμευμένων στρωματικών προγονικών κυττάρων. Έχει διαπιστωθεί ότι παρατηρείται υψηλός ρυθμός πολλαπλασιασμού δεσμευμένων προγονικών κυττάρων μόνο παρουσία κυττάρων RS-1. Με τη σειρά τους, τα κύτταρα RS-1 αυξάνουν τον ρυθμό ανάπτυξής τους υπό την επίδραση παραγόντων που εκκρίνονται από τα πιο ώριμα παράγωγα πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων. Φαίνεται ότι τα κύτταρα RS-1 είναι μια υποκατηγορία μη δεσμευμένων MSC ικανών για ανακύκλωση. In vitro, τα στρωματικά προγονικά κύτταρα μυελού των οστών ανθεκτικά στην 5-φθοροουρακίλη χαρακτηρίζονται από χαμηλή περιεκτικότητα σε RNA και υψηλή έκφραση του γονιδίου της ορνιθίνης δεκαρβοξυλάσης, ενός δείκτη μη πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων.

Ο εντατικός πολλαπλασιασμός των στρωματικών προγονικών κυττάρων ξεκινά μετά τη στερέωσή τους στο υπόστρωμα. Σε αυτή την περίπτωση, εκφράζεται το προφίλ δεικτών των ελάχιστα διαφοροποιημένων κυττάρων: SH2 (υποδοχέας TGF-(3)), SH3 (τομέας πρωτεΐνης σηματοδότησης), κολλαγόνο τύπου Ι και III, φιμπρονεκτίνη, υποδοχείς προσκόλλησης VCAM-1 (CD106) και ICAM (CD54), καδερίνη-11, CD44, CD71 (υποδοχέας τρανσφερίνης), CD90, CD120a και CD124, αλλά χωρίς την έκφραση χαρακτηριστικών δεικτών αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων (CD34, CD14, CD45). Η κλωνική ανάπτυξη καθιστά δυνατή την επαναλαμβανόμενη διέλευση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων με τον σχηματισμό πολυάριθμων γενετικά ομοιογενών στρωματικών προγονικών πολυδύναμων κυττάρων σε καλλιέργεια. Μετά από 2-3 διελεύσεις, ο αριθμός τους φτάνει τα 50-300 εκατομμύρια. Σε μια καλλιέργεια επαρκούς πυκνότητας, μετά τη διακοπή του πολλαπλασιασμού, τα στρωματικά προγονικά κύτταρα, σε αντίθεση με τους ινοβλάστες του αιμοποιητικού ιστού, διαφοροποιούνται σε λιποκύτταρα, μυοκύτταρα, χόνδρινα και οστικά κύτταρα. Ένας συνδυασμός τριών ρυθμιστικών σημάτων διαφοροποίησης, συμπεριλαμβανομένης της 1-μεθυλο-ισοβουτυλξανθίνης (ενός επαγωγέα ενδοκυτταρικού σχηματισμού cAMP), της δεξαμεθαζόνης (ενός αναστολέα των φωσφολιπασών Α και C) και της ινδομεθακίνης (ενός αναστολέα της κυκλοοξυγενάσης, η οποία μειώνει επίσης τη δραστικότητα της θρομβοξάνης συνθάσης), μετατρέπει έως και 95% των προγονικών μεσεγχυματικών κυττάρων σε λιποκύτταρα. Ο σχηματισμός λιποκυττάρων από ανώριμα στρωματικά στοιχεία επιβεβαιώνεται από την έκφραση του γονιδίου της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης, την ιστοχημική ανίχνευση απολιποπρωτεινών και υπεροξεισωματικών υποδοχέων. Κύτταρα του ίδιου κλώνου υπό την επίδραση του TGF-b σε μέσο χωρίς ορό δημιουργούν έναν ομοιογενή πληθυσμό χονδροκυττάρων. Η πολυστρωματική κυτταροκαλλιέργεια αυτού του χόνδρινου ιστού χαρακτηρίζεται από μια ανεπτυγμένη μεσοκυτταρική μήτρα που αποτελείται από πρωτεογλυκάνη και κολλαγόνο τύπου II. Σε θρεπτικό μέσο με 10%, η επίδραση ενός συμπλόκου σήματος διαφοροποίησης που αποτελείται από β-γλυκεροφωσφορικό (έναν ανόργανο δότη φωσφορικού), ασκορβικό οξύ και δεξαμεθαζόνη στην ίδια καλλιέργεια στρωματικών προγονικών κυττάρων οδηγεί στον σχηματισμό κυτταρικών συσσωματωμάτων. Σε τέτοια κύτταρα, παρατηρείται προοδευτική αύξηση της δραστικότητας της αλκαλικής φωσφατάσης και των επιπέδων οστεοποντίνης, υποδεικνύοντας τον σχηματισμό οστικού ιστού, η ανοργανοποίηση των κυττάρων του οποίου επιβεβαιώνεται από μια προοδευτική αύξηση της ενδοκυτταρικής περιεκτικότητας σε ασβέστιο.

Σύμφωνα με ορισμένα δεδομένα, η ικανότητα των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων για απεριόριστη διαίρεση και αναπαραγωγή διαφόρων τύπων κυττάρων της γραμμής μεσεγχυματικής διαφοροποίησης συνδυάζεται με υψηλό βαθμό πλαστικότητας. Όταν εισάγονται στις κοιλίες ή στη λευκή ουσία του εγκεφάλου, τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα μεταναστεύουν στο παρέγχυμα του νευρικού ιστού και διαφοροποιούνται σε παράγωγα της νευρογλοιακής ή νευρωνικής κυτταρικής σειράς. Επιπλέον, υπάρχουν πληροφορίες για τη διαφοροποίηση των MSC σε αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα τόσο in vitro όσο και in vivo. Μια πιο εις βάθος ανάλυση σε ορισμένες μελέτες έχει προσδιορίσει μια εξαιρετικά υψηλή πλαστικότητα των MSC, η οποία εκδηλώνεται στην ικανότητά τους να διαφοροποιούνται σε αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα, νευρώνες, καρδιομυοκύτταρα, λεία μυϊκά κύτταρα και σκελετικά μυϊκά κύτταρα. Ορισμένες μελέτες σχετικά με το δυναμικό διαφοροποίησης των MSC in vitro και in vivo έχουν διαπιστώσει ότι τα πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα μυελού των οστών τελικά διαφοροποιούνται σε κυτταρικές σειρές που σχηματίζουν οστό, χόνδρο, μυ, νεύρο και λιπώδη ιστό, καθώς και τένοντες και στρώμα που υποστηρίζουν την αιματοποίηση.

Ωστόσο, άλλες μελέτες δεν κατάφεραν να αποκαλύψουν σημάδια περιορισμού της πολυδυναμικότητας του γονιδιώματος των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων και των προγονικών πληθυσμών των στρωματικών κυττάρων, αν και μελετήθηκαν περισσότεροι από 200 κλώνοι MSC που απομονώθηκαν από μία πρωτογενή καλλιέργεια για να ελεγχθεί η πιθανή πολυδυναμικότητα των στρωματικών κυττάρων. Η συντριπτική πλειοψηφία των κλώνων in vitro διατήρησε την ικανότητα διαφοροποίησης σε οστεογενετικές, χονδρογενετικές και λιπογενετικές κατευθύνσεις. Όταν αποκλείστηκε η πιθανότητα μετανάστευσης των κυττάρων-δεκτών με μεταμόσχευση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων κάτω από την νεφρική κάψουλα ή σε θαλάμους διάχυσης, αποδείχθηκε ότι τα στρωματικά προγονικά κύτταρα in situ διατηρούν έναν ετερογενή φαινότυπο, ο οποίος υποδηλώνει είτε την απουσία παραγόντων περιορισμού στη ζώνη μεταμόσχευσης είτε την απουσία πολυδυναμικότητας των MSC καθαυτή. Ταυτόχρονα, επιτρέπεται η ύπαρξη ενός σπάνιου τύπου σωματικών πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων, τα οποία είναι κοινοί πρόδρομοι όλων των ενήλικων βλαστικών κυττάρων.

Η πολλαπλή, αλλά όχι η πολυδύναμη, ισχύς των πραγματικών μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων, τα οποία αποτελούν ένα πολύ μικρό ποσοστό των κυττάρων του μυελού των οστών και είναι ικανά να πολλαπλασιάζονται υπό ορισμένες συνθήκες κατά την in vitro καλλιέργεια χωρίς διαφοροποίηση, αποδεικνύεται από την επαγόμενη δέσμευσή τους σε κύτταρα οστού, χόνδρου, λιπώδους ιστού, μυϊκού ιστού, καθώς και σε τενοκύτταρα και στρωματικά στοιχεία που υποστηρίζουν την αιματοποίηση. Κατά κανόνα, η παρατεταμένη έκθεση σε ένα μέσο καλλιέργειας με ορό εμβρύου μοσχαριού προκαλεί την απελευθέρωση MSC σε δεσμευμένα στρωματικά προγονικά κύτταρα, οι απόγονοι των οποίων υφίστανται αυθόρμητη τελική διαφοροποίηση. In vitro, είναι δυνατό να επιτευχθεί στοχευμένος σχηματισμός οστεοβλαστών με την προσθήκη δεξαμεθαζόνης, β-γλυκεροφωσφορικού και ασκορβικού οξέος στο μέσο προετοιμασίας, ενώ ένας συνδυασμός σημάτων διαφοροποίησης δεξαμεθαζόνης και ινσουλίνης προκαλεί τον σχηματισμό λιποκυττάρων.

Έχει διαπιστωθεί ότι πριν εισέλθουν στο στάδιο της τελικής διαφοροποίησης, τα MSCs του μυελού των οστών αρχικά διαφοροποιούνται σε μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα που μοιάζουν με ινοβλάστες υπό ορισμένες συνθήκες καλλιέργειας. Παράγωγα αυτών των κυττάρων in vivo συμμετέχουν στο σχηματισμό οστών, χόνδρων, τενόντων, λιπώδους και μυϊκού ιστού, καθώς και του στρώματος που υποστηρίζει την αιματοποίηση. Πολλοί συγγραφείς κατανοούν τον όρο «πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα» ως προς τα ίδια τα MSCs και τα δεσμευμένα στρωματικά προγονικά κύτταρα του μυελού των οστών και των μεσεγχυματικών ιστών. Η κλωνική ανάλυση πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων μυελού των οστών έδειξε ότι λίγο περισσότερο από το ένα τρίτο όλων των κλώνων διαφοροποιούνται σε οστεο-, χονδρο- και λιποκύτταρα, ενώ τα κύτταρα των υπόλοιπων κλώνων έχουν μόνο οστεογενετικό δυναμικό και σχηματίζουν μόνο χονδρο- και οστεοκύτταρα. Ένας κλώνος πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων όπως το BMC-9, υπό κατάλληλες μικροπεριβαλλοντικές συνθήκες, διαφοροποιείται σε κύτταρα με φαινότυπο και λειτουργικά χαρακτηριστικά όχι μόνο οστεοβλαστών, χονδροκυττάρων και λιποκυττάρων, αλλά και στρωματικών κυττάρων που υποστηρίζουν την αιματοποίηση. Ένας κλώνος κυττάρων RCJ3.1 που απομονώθηκε από μυελό των οστών εμβρύου αρουραίου διαφοροποιείται σε μεσεγχυματικά κύτταρα διαφόρων φαινοτύπων. Υπό τη συνδυασμένη δράση ασκορβικού οξέος, β-γλυκεροφωσφορικού και δεξαμεθαζόνης, τα κυτταρικά στοιχεία αυτού του κλώνου σχηματίζουν πρώτα πολυπυρηνικά μυοκύτταρα και στη συνέχεια, διαδοχικά, λιποκύτταρα, χονδροκύτταρα και νησίδια μεταλλοποιημένου οστικού ιστού. Ο πληθυσμός των κοκκιωδών κυττάρων από το περιόστεο εμβρύων αρουραίου αντιστοιχεί σε μη δεσμευμένα πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα, καθώς χαρακτηρίζεται από χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού, δεν εκφράζει δείκτες διαφοροποίησης και υπό συνθήκες καλλιέργειας διαφοροποιείται για να σχηματίσει χονδρο-, οστεο- και λιποκύτταρα, καθώς και λεία μυϊκά κύτταρα.

Επομένως, θα πρέπει να αναγνωριστεί ότι το ζήτημα της πολυδύναμης ή πολυδύναμης ικανότητας του γονιδιώματος των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων παραμένει ανοιχτό, γεγονός που, κατά συνέπεια, επηρεάζει και τις ιδέες σχετικά με το δυναμικό διαφοροποίησης των στρωματικών προγονικών κυττάρων, το οποίο επίσης δεν έχει οριστικά τεκμηριωθεί.

Ένα πειραματικά αποδεδειγμένο και σημαντικό χαρακτηριστικό των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων είναι η ικανότητά τους να εγκαταλείπουν την ιστική θέση και να κυκλοφορούν στη γενική κυκλοφορία του αίματος. Για να ενεργοποιηθεί το πρόγραμμα γενετικής διαφοροποίησης, τέτοια κυκλοφορούντα βλαστοκύτταρα πρέπει να εισέλθουν στο κατάλληλο μικροπεριβάλλον. Έχει αποδειχθεί ότι με τη συστηματική εισαγωγή MSCs στην κυκλοφορία του αίματος των ζώων-δεκτών, τα ανώριμα κύτταρα εμφυτεύονται σε διάφορα όργανα και ιστούς, και στη συνέχεια διαφοροποιούνται σε κύτταρα αίματος, μυοκύτταρα, λιποκύτταρα, χονδροκύτταρα και ινοβλάστες. Κατά συνέπεια, σε τοπικές ζώνες ιστών, συμβαίνουν αλληλεπιδράσεις ρύθμισης σήματος μεταξύ μη δεσμευμένων και δεσμευμένων στρωματικών προγονικών κυττάρων, καθώς και μεταξύ αυτών και των γύρω ώριμων κυττάρων. Υποτίθεται ότι η διαφοροποίηση προκαλείται από παρακρινείς ρυθμιστικούς παράγοντες μεσεγχυματικής και μη μεσεγχυματικής προέλευσης (αυξητικοί παράγοντες, εικοσανοειδή, μόρια εξωκυτταρικής μήτρας), οι οποίοι παρέχουν χωρικές και χρονικές συνδέσεις στο μικροπεριβάλλον των πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων. Συνεπώς, η τοπική βλάβη στον μεσεγχυματικό ιστό θα πρέπει να οδηγήσει στον σχηματισμό ζωνών του μικροπεριβάλλοντος πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων που είναι ποιοτικά διαφορετικές από το σύμπλεγμα ρυθμιστικών σημάτων των άθικτων ιστών, στους οποίους συμβαίνουν φυσιολογικές και όχι επανορθωτικές διαδικασίες αναγέννησης. Αυτή η διαφορά είναι εξαιρετικά σημαντική όσον αφορά την εξειδίκευση του κυτταρικού φαινοτύπου στο φυσιολογικό και στο μικροπεριβάλλον που προκαλείται από βλάβη.

Σύμφωνα με τις έννοιες, εδώ ενσωματώνονται οι μηχανισμοί της θεμελιώδους διαφοράς μεταξύ των δύο γνωστών διεργασιών - της φυσιολογικής αναγέννησης και του φλεγμονώδους πολλαπλασιασμού. Η πρώτη από αυτές τελειώνει με την αποκατάσταση της εξειδικευμένης κυτταρικής σύνθεσης του ιστού και της λειτουργίας του, ενώ το αποτέλεσμα της εφαρμογής της διαδικασίας πολλαπλασιασμού είναι ο σχηματισμός ώριμων στοιχείων συνδετικού ιστού και η απώλεια της λειτουργίας της κατεστραμμένης ζώνης ιστού. Έτσι, για την ανάπτυξη βέλτιστων προγραμμάτων για τη χρήση πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων στην αναγεννητική-πλαστική ιατρική, είναι απαραίτητη μια διεξοδική μελέτη των χαρακτηριστικών της επίδρασης των μικροπεριβαλλοντικών παραγόντων στη διαφοροποίηση των MSC.

Η εξάρτηση της δομής του διαμερίσματος των βλαστικών κυττάρων από τους κυτταρικούς παρα- και αυτοκρινείς ρυθμιστές, η έκφραση των οποίων ρυθμίζεται από εξωτερικά σήματα, είναι αναμφισβήτητη. Μεταξύ των λειτουργιών των ρυθμιστικών παραγόντων, οι πιο σημαντικές είναι ο έλεγχος της ασύμμετρης διαίρεσης των MSC και η έκφραση γονιδίων που καθορίζουν τα στάδια δέσμευσης και τον αριθμό των κυτταρικών διαιρέσεων. Τα εξωτερικά σήματα, από τα οποία εξαρτάται η περαιτέρω ανάπτυξη των MSC, παρέχονται από το μικροπεριβάλλον τους. Σε ανώριμη κατάσταση, τα MSC πολλαπλασιάζονται για μεγάλο χρονικό διάστημα, διατηρώντας παράλληλα την ικανότητα διαφοροποίησης σε σειρές λιποκυττάρων, μυοϊνοβλαστών, αιματογενούς στρώματος ιστού, χόνδρινων και οστικών κυττάρων. Έχει διαπιστωθεί ότι ένας περιορισμένος πληθυσμός CD34-αρνητικών στρωματικών κυτταρικών στοιχείων που κυκλοφορούν στο αίμα επιστρέφει από τη γενική κυκλοφορία του αίματος στο στρώμα του μυελού των οστών, όπου μετασχηματίζεται σε σειρές CD34-θετικών αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η ανακυκλοφορία των προγονικών μεσεγχυματικών κυττάρων στην κυκλοφορία του αίματος διατηρεί την ισορροπία των ιστών των στρωματικών βλαστικών κυττάρων σε διαφορετικά όργανα κινητοποιώντας μια κοινή ομάδα ανώριμων στρωματικών στοιχείων του μυελού των οστών. Η διαφοροποίηση των MSCs σε κύτταρα με πολλαπλούς μεσεγχυματικούς φαινοτύπους και η συμμετοχή τους στην αναγέννηση ή την επιδιόρθωση οστών, χόνδρων, λιπώδους ιστού και τενόντων in vivo έχει αποδειχθεί χρησιμοποιώντας μοντέλα υιοθετικής μεταφοράς σε πειραματόζωα. Σύμφωνα με άλλους συγγραφείς, η μακρινή μετανάστευση των MSCs κατά μήκος της αγγειακής κοίτης συνδυάζεται με κίνηση μικρής απόστασης ή τοπική κίνηση πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων εντός του ιστού κατά την επιδιόρθωση του χόνδρου, την αναγέννηση των μυών και άλλες αποκαταστατικές διεργασίες.

Τα τοπικά αποθέματα βλαστικών κυττάρων της βάσης του στρωματικού ιστού λειτουργούν ως πηγή κυττάρων στις διαδικασίες της φυσιολογικής αναγέννησης των ιστών και αναπληρώνονται με τη μεταφορά των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων (MESCs) σε μακρινές περιοχές, καθώς καταναλώνονται οι πόροι του στρωματικού ιστού. Ωστόσο, σε συνθήκες ανάγκης για επείγουσα κινητοποίηση του επανορθωτικού κυτταρικού δυναμικού, για παράδειγμα, σε περίπτωση πολυτραύματος, ολόκληρο το κλιμάκιο των MSCs συμμετέχει στις διαδικασίες της επανορθωτικής αναγέννησης και τα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα του μυελού των οστών στρατολογούνται στην περιφέρεια μέσω της γενικής ροής αίματος.

Μεταμόσχευση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων

Ορισμένες παραλληλίες μπορούν να εντοπιστούν μεταξύ των διαδικασιών φυσιολογικής αναγέννησης ιστών και του σχηματισμού τους κατά την ενδομήτρια ανάπτυξη. Στην εμβρυογένεση στον άνθρωπο και τα θηλαστικά, ο σχηματισμός διαφόρων τύπων εξειδικευμένων κυττάρων συμβαίνει από την εκτο-, μεσο- και ενδοδερμική δεξαμενή των βλαστικών στρωμάτων, αλλά με την υποχρεωτική συμμετοχή του μεσεγχύματος. Το χαλαρό κυτταρικό δίκτυο του εμβρυϊκού μεσεγχυματικού ιστού εκτελεί πολυάριθμες ρυθμιστικές, μεταβολικές, δομικές και μορφογενετικές λειτουργίες. Η τοποθέτηση προσωρινών οργάνων συμβαίνει μόνο μετά τη συμπύκνωση του μεσεγχύματος λόγω της κλωνογενετικής ανάπτυξης των προγονικών κυττάρων, τα οποία παράγουν τα πρωτογενή μορφογενετικά σήματα της οργανογένεσης. Τα στρωματικά παράγωγα του εμβρυϊκού μεσεγχύματος δημιουργούν το κυτταρικό πλαίσιο των προσωρινών οργάνων και αποτελούν τη βάση για τη μελλοντική τους ενεργειακή πλαστική τροφοδοσία λόγω της ανάπτυξης πρωτογενών αιμοφόρων και λεμφικών αγγείων. Με άλλα λόγια, τα στρωματικά στοιχεία της μικροκυκλοφορικής μονάδας των εμβρυϊκών οργάνων εμφανίζονται πριν από τον σχηματισμό των δομικών και λειτουργικών τους μονάδων. Επιπλέον, η ενεργή μετανάστευση μεσεγχυματικών κυττάρων κατά την οργανογένεση παρέχει χωρικό προσανατολισμό των αναπτυσσόμενων οργάνων σημειώνοντας τα όρια όγκου τους μέσω περιορισμού των ομοιοτικών τύπων Hox. Το στρωματικό πλαίσιο χρησιμεύει επίσης ως βάση για τη συναρμολόγηση δομικών και λειτουργικών μονάδων παρεγχυματικών οργάνων, τα οποία συχνά περιλαμβάνουν μορφογενετικά και λειτουργικά εντελώς διαφορετικά κύτταρα. Κατά συνέπεια, κατά την εμβρυογένεση, οι λειτουργίες του μεσεγχύματος είναι πρωταρχικές και πραγματοποιούνται μέσω της παραγωγής ρυθμιστικών σημάτων που ενεργοποιούν τον περιφερειακό πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση των προγονικών επιθηλιακών κυττάρων. Τα εμβρυϊκά μεσεγχυματικά κύτταρα παράγουν αυξητικούς παράγοντες όπως HGF-b, HGF-b, ΕΝΥ, για τους οποίους τα παρεγχυματικά προγονικά κύτταρα έχουν αντίστοιχους υποδοχείς. Σε διαφοροποιημένο ώριμο ιστό ενός ενήλικου οργανισμού, το στρωματικό δίκτυο κυττάρων παράγει επίσης σήματα για τη διατήρηση της βιωσιμότητας και του πολλαπλασιασμού των προγονικών κυττάρων μη μεσεγχυματικής προέλευσης. Ωστόσο, το φάσμα των στρωματικών ρυθμιστικών σημάτων στην μεταγεννητική οντογένεση είναι διαφορετικό (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, κ.λπ.) και στοχεύει στη διασφάλιση της φυσιολογικής αναγέννησης ή επιδιόρθωσης των κατεστραμμένων ιστών. Επιπλέον, τα φασματικά χαρακτηριστικά των στρωματικών ρυθμιστικών παραγόντων σε κάθε τύπο ιστού και ακόμη και εντός ενός οργάνου είναι διαφορετικά. Συγκεκριμένα, η αιματοποίηση και η λεμφοποίηση με τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών και ανοσοεπαρκών κυττάρων εμφανίζονται μόνο σε ορισμένα όργανα, εντός των ορίων των οποίων λειτουργεί το στρωματικό μικροπεριβάλλον, παρέχοντας συνθήκες για την ωρίμανση των αιμοποιητικών και λεμφοειδών κυττάρων. Η ικανότητα των αιμοποιητικών και λεμφοειδών κυττάρων να αναπληρώνουν ένα δεδομένο όργανο, να πολλαπλασιάζονται και να ωριμάζουν στις μικροδομικές του θέσεις εξαρτάται από τους ρυθμιστικούς παράγοντες του μικροπεριβάλλοντος.

Μεταξύ των συστατικών της εξωκυτταρικής μήτρας που παράγουν τα πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα, πρέπει να σημειωθούν η φιμπρονεκτίνη, η λαμινίνη, το κολλαγόνο και οι πρωτεογλυκάνες, καθώς και το CD44 (υποδοχέας υαλουρονάνης και οστεοποντίνης), τα οποία συμμετέχουν σημαντικά στην οργάνωση των διακυτταρικών αλληλεπιδράσεων και στον σχηματισμό της εξωκυτταρικής μήτρας στον μυελό των οστών και στον οστικό ιστό. Έχει αποδειχθεί ότι τα πολυδύναμα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα του μυελού των οστών δημιουργούν ένα στρωματικό μικροπεριβάλλον που παρέχει επαγωγικά και ρυθμιστικά σήματα όχι μόνο στα MSCs, αλλά και στα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα και σε άλλα μη μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα του μυελού των οστών. Είναι γνωστό ότι η συμμετοχή των MSCs στην αιματοποίηση καθορίζεται από την ικανότητά τους να διαφοροποιούνται σε στρωματικά κύτταρα που υποστηρίζουν την αιματοποίηση, και αυτό το διδακτικό σήμα λαμβάνεται από τα MSCs απευθείας από τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο στην καλλιέργεια το δίκτυο των στρωματικών προγονικών κυττάρων χρησιμεύει ως τροφοδότης βάσης για την ανάπτυξη όλων των κλώνων των αιμοποιητικών κυττάρων.

Σε έναν ώριμο οργανισμό, η ένταση της αιμοποίησης και της λεμφοποίησης βρίσκεται σε κατάσταση δυναμικής ισορροπίας με την «δαπάνη» των ώριμων αιμοσφαιρίων και των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος στην περιφέρεια. Δεδομένου ότι τα στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών και των λεμφοειδών οργάνων ανανεώνονται εξαιρετικά σπάνια, δεν συμβαίνει σημαντική αναδιάρθρωση των στρωματικών δομών σε αυτά. Το σύστημα μπορεί να βγει από τη δυναμική ισορροπία με μηχανική βλάβη σε οποιοδήποτε από τα όργανα της αιμοποίησης ή της λεμφοποίησης, η οποία οδηγεί σε ομοιόμορφες διαδοχικές αλλαγές που αφορούν όχι μόνο και όχι τόσο τα αιματοποιητικά ή λεμφοειδή στοιχεία όσο τις στρωματικές δομές του κατεστραμμένου οργάνου. Στη διαδικασία της επανορθωτικής αναγέννησης, σχηματίζεται πρώτα η στρωματική βάση, η οποία στη συνέχεια αναπληρώνεται από αιματοποιητικά ή ανοσοεπαρκή κύτταρα. Αυτό το γνωστό γεγονός καθιστά την μετατραυματική αναγέννηση ένα βολικό μοντέλο για τη μελέτη του στρωματικού μικροπεριβάλλοντος των αιμοποιητικών οργάνων. Συγκεκριμένα, η μηχανική κένωση της μυελικής κοιλότητας των σωληνοειδών οστών χρησιμοποιείται για τη μελέτη της επανορθωτικής αναγέννησης του μυελού των οστών - της απόξεσης, η οποία επιτρέπει την γρήγορη και αποτελεσματική απομάκρυνση του αιμοποιητικού ιστού από την κατάσταση δυναμικής ισορροπίας. Κατά τη μελέτη των διαδικασιών επανορθωτικής αναγέννησης των αιμοποιητικών και στρωματικών συστατικών του μυελού των οστών μετά από μηχανική κένωση της μυελικής κοιλότητας της κνήμης των ινδικών χοιριδίων, διαπιστώθηκε ότι δεν υπάρχει άμεση συσχέτιση μεταξύ των δεικτών αναγέννησης των αιμοποιητικών και στρωματικών κυττάρων (ο αριθμός των αιμοποιητικών κυττάρων, η συγκέντρωση και ο αριθμός των στρωματικών προγονικών κυττάρων). Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι η αύξηση του πληθυσμού των στρωματικών προγονικών κυττάρων εμφανίζεται σε προγενέστερο χρόνο μετά την απόξεση και οι ίδιοι οι στρωματικοί ινοβλάστες γίνονται θετικοί στη φωσφατάση, κάτι που είναι χαρακτηριστικό του οστεογενετικού ιστού. Έχει επίσης διαπιστωθεί ότι η απόξεση 3-5 σωληνοειδών οστών οδηγεί στην ανάπτυξη αυτού του κυτταρικού πληθυσμού στον μυελό των οστών μη χειρουργημένων οστών, ακόμη και στον σπλήνα, ο οποίος στα ινδικά χοιρίδια είναι αποκλειστικά λεμφοποιητικό όργανο.

Η μορφολογική εικόνα των επανορθωτικών διεργασιών στον μυελό των οστών των αποξηραμένων κνημών ινδικών χοιριδίων αντιστοιχεί γενικά στα δεδομένα που περιγράφονται στη βιβλιογραφία και ελήφθησαν σε πειράματα σε ζώα άλλων ειδών, και η δυναμική των αλλαγών που συμβαίνουν μετά την αφαίρεση του αιμοποιητικού ιστού είναι η ίδια για όλα τα ζωικά είδη και η διαφορά αφορά μόνο τις χρονικές παραμέτρους. Μορφολογικά, η σειρά φάσεων της αποκατάστασης της αιματοποίησης στην άδεια μυελική κοιλότητα αποτελείται από διαδοχικές διεργασίες οργάνωσης θρόμβου αίματος, σχηματισμού χονδροειδούς ινώδους οστικού ιστού, απορρόφησης, ανάπτυξης ημιτονοειδών και σχηματισμού δικτυωτού στρώματος, το οποίο στη συνέχεια αναπληρώνεται με αιμοποιητικά στοιχεία. Σε αυτή την περίπτωση, ο αριθμός των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων στη διαδικασία αναγέννησης ιστού μυελού των οστών αυξάνεται παράλληλα με την αύξηση της περιεκτικότητας σε αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα.

Ο Yu. Gerasimov και οι συν-συγγραφείς (2001) συνέκριναν τις αλλαγές στον αριθμό των αιμοποιητικών κυττάρων και τον αριθμό των στρωματικών προγονικών κυττάρων σε μεμονωμένες φάσεις της διαδικασίας αναγέννησης. Αποδείχθηκε ότι οι ποσοτικές αλλαγές στα κύτταρα του μυελού των οστών στο αποξηραμένο οστό αντιστοιχούν στη δυναμική των μορφολογικών χαρακτηριστικών της αναγέννησης. Οι συγγραφείς συνδέουν τη μείωση της κυτταρικής περιεκτικότητας στο αναγεννημένο κατά τη διάρκεια των πρώτων τριών ημερών με τον θάνατο των αιμοποιητικών κυττάρων λόγω της δυσμενούς επίδρασης του μικροπεριβάλλοντος που δημιουργείται από τον πολλαπλασιαζόμενο δικτυωτό ιστό στον διατηρημένο μυελό των οστών στην περιοχή της επίφυσης, καθώς και με τον σχηματισμό εστιών οστεοειδούς ιστού στην τελευταία και αγγειακή βλάβη κατά την απόξεση. Την 7η-12η ημέρα, η αύξηση του επιπέδου των πυρηνοποιημένων κυττάρων συμπίπτει με την εμφάνιση μεμονωμένων εστιών μυελοειδούς αιματοποίησης στις ζώνες πολλαπλασιασμού των στρωματικών στοιχείων. Την 20ή ημέρα, εμφανίζονται σημαντικές περιοχές αναγεννημένου μυελού των οστών και καλά αναπτυγμένων κόλπων, η οποία συνοδεύεται από σημαντική αύξηση του συνολικού αριθμού των κυττάρων. Ωστόσο, ο αριθμός των αιμοποιητικών στοιχείων κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου είναι 68% του επιπέδου ελέγχου. Αυτό συμφωνεί με προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα ότι ο αριθμός των αιμοποιητικών κυττάρων μετά την απόξεση φτάνει στο φυσιολογικό επίπεδο μόνο την 35η-40ή ημέρα μετά την επέμβαση.

Στην πρώιμη μετατραυματική περίοδο, η κύρια πηγή για την αποκατάσταση της αιματοποίησης είναι τα τοπικά κυτταρικά στοιχεία που διατηρούνται κατά την απόξεση. Σε μεταγενέστερα στάδια, η κύρια πηγή αναγέννησης του αιμοποιητικού ιστού του μυελού των οστών είναι τα βλαστοκύτταρα που αναπληρώνουν τις ελεύθερες στρωματικές ζώνες. Όσον αφορά τις μεμονωμένες κατηγορίες στρωματικών κυττάρων (ενδοθηλιακά, δικτυωτά και οστεογενή), οι πηγές που διασφαλίζουν τον σχηματισμό τους κατά την αναδιοργάνωση της κοιλότητας του μυελού των οστών παραμένουν ασαφείς. Τα αποτελέσματα της μελέτης του Yu. V. Gerasimov και των συν-συγγραφέων (2001) δείχνουν ότι στον μυελό των οστών που διατηρείται μετά την απόξεση, η συγκέντρωση των κυττάρων που σχηματίζουν αποικίες ινοβλαστών είναι σημαντικά υψηλότερη από ό,τι στον φυσιολογικό μυελό των οστών. Οι συγγραφείς πιστεύουν ότι η απόξεση οδηγεί σε μια πιο εντατική επιλεκτική έκπλυση των αιμοποιητικών κυττάρων σε σύγκριση με τα στρωματικά κύτταρα που σχηματίζουν αποικίες, τα οποία συμμετέχουν στο σχηματισμό του στρώματος και συνδέονται ισχυρότερα με την κύρια ουσία του από τα αιμοποιητικά κύτταρα.

Η δυναμική της μεταβολής στον αριθμό των κυττάρων που σχηματίζουν αποικίες ινοβλαστών συσχετίζεται με την ένταση των διεργασιών οστεογένεσης, την επακόλουθη απορρόφηση των οστικών δοκίδων και τον σχηματισμό δικτυωτού στρώματος, το οποίο κατοικείται από αιμοποιητικά κύτταρα. Τα περισσότερα από τα στρωματικά προγονικά κύτταρα στις καθορισμένες περιόδους αναγέννησης σχηματίζουν χονδροειδή ινώδη οστικό ιστό και δικτυωτό στρώμα. Σε περίπτωση μηριαίων καταγμάτων υπό συνθήκες παρατεταμένης οστεοσύνθεσης, την 5η ημέρα στη ζώνη αναγέννησης η συγκέντρωση και ο αριθμός των κυττάρων που σχηματίζουν αποικίες ινοβλαστών αυξάνεται και κατά την περίοδο εντατικού σχηματισμού οστού ο αριθμός τους αυξάνεται 6 φορές. Είναι γνωστό ότι τα κύτταρα μυελού των οστών που σχηματίζουν αποικίες ινοβλαστών έχουν οστεογενετικές ιδιότητες. Ο αριθμός των στρωματικών προγονικών κυττάρων αυξάνεται πριν από την εγκατάσταση της αποξηραμένης περιοχής του μυελού των οστών από αιμοποιητικά κύτταρα. Αυτό συμφωνεί με τα δεδομένα ότι τα στρωματικά κύτταρα παρέχουν τον σχηματισμό ενός αιμοποιητικού μικροπεριβάλλοντος. Προφανώς, η δημιουργία ενός αιμοποιητικού μικροπεριβάλλοντος αντιστοιχεί σε ένα ορισμένο επίπεδο αναγέννησης του στρωματικού ιστού και ο αριθμός των αιμοποιητικών κυττάρων αυξάνεται με την επέκταση της στρωματικής πλατφόρμας που είναι κατάλληλη για αιματοποίηση.

Μεγαλύτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα δεδομένα των συγγραφέων ότι αμέσως μετά την απόξεση, ο αριθμός των στρωματικών προγονικών κυττάρων στα απομακρυσμένα μέρη του σκελετού αυξάνεται. Ξεκινώντας από την έκτη ώρα και έως και την εικοστή ημέρα, παρατηρείται μια υπερδιπλάσια αύξηση τόσο στη συγκέντρωση όσο και στον αριθμό των κυττάρων που σχηματίζουν αποικίες ινοβλαστών στην αντίπλευρη κνήμη. Ο μηχανισμός αυτού του φαινομένου πιθανώς σχετίζεται με το γεγονός ότι η μαζική βλάβη του μυελού των οστών οδηγεί στον σχηματισμό μεγάλου αριθμού θρόμβων αίματος με ταυτόχρονη καταστροφή σημαντικού αριθμού αιμοπεταλίων και την απελευθέρωση του παράγοντα ανάπτυξης που προέρχεται από τα αιμοπετάλια (PDGF) στο αίμα, ο οποίος είναι γνωστό ότι προκαλεί πολλαπλασιασμό των κυττάρων που σχηματίζουν αποικίες ινοβλαστών που βρίσκονται στο σώμα εκτός της πολλαπλασιαστικής δεξαμενής. Σε πειράματα σε κουνέλια, η τοπική χορήγηση MSCs προάγει την αποκατάσταση του χόνδρινου ιστού της χειρουργικά κατεστραμμένης άρθρωσης του γόνατος, η οποία μπορεί να σχετίζεται με τον σχηματισμό χονδροκυττάρων που προέρχονται από τα εγχυμένα MSCs. Ωστόσο, η επανορθωτική αναγέννηση των οστικών ελαττωμάτων σε εργαστηριακούς αρουραίους ενισχύεται σημαντικά με τη χρήση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων που περικλείονται σε κεραμικό πλαίσιο. Επομένως, μπορεί να υποτεθεί ότι, αν όχι το RBOC, τότε κάποιος άλλος παράγοντας που προέρχεται από κατεστραμμένα στρωματικά κύτταρα ασκεί μια απομακρυσμένη διεγερτική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων σε άθικτες ζώνες μυελού των οστών και διεγείρει τη μετανάστευσή τους στην περιοχή του ελαττώματος του μυελού των οστών. Με τη σειρά του, αυτό αντικρούεται από βιβλιογραφικά δεδομένα προηγούμενων ετών που δείχνουν ότι τα στρωματικά κύτταρα που είναι υπεύθυνα για το μικροπεριβάλλον, σε αντίθεση με τα αιμοποιητικά κύτταρα, δεν είναι ικανά για μετανάστευση και προέρχονται από τοπικές πηγές.

Παρ 'όλα αυτά, τα αποτελέσματα της μελέτης του Yu. Gerasimov και των συν-συγγραφέων (2001) δείχνουν ότι το μηχανικό τραύμα προκαλεί όχι μόνο μια απότομη αναδιάρθρωση του στρωματικού ιστού στο αποξεσμένο οστό, αλλά και σημαντικές αλλαγές στο στρώμα σε απομακρυσμένα άθικτα οστά, δηλαδή, υπάρχει μια συστηματική απόκριση του στρωματικού ιστού στο τοπικό τραύμα. Επιπλέον, όταν προκαλείται πολυτραύμα - πολλαπλή απόξεση - αυτή η αντίδραση ενισχύεται και παρατηρείται όχι μόνο στο χειρουργημένο οστό και στα απομακρυσμένα μέρη του σκελετού, αλλά και στα λεμφικά όργανα, ιδιαίτερα στον σπλήνα. Ο μηχανισμός μιας τέτοιας συστηματικής απόκρισης του στρωματικού ιστού του μυελού των οστών και του σπλήνα στο τοπικό τραύμα και το πολυτραύμα παραμένει άγνωστος. Υποτίθεται ότι αυτή η διαδικασία σχετίζεται με τη δράση ενός χυμικού παράγοντα που εκκρίνεται από το μεσεγχυματικό στρώμα της μυελικής κοιλότητας του μυελού των οστών. Η πιθανότητα παραγωγής από τα στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών και του σπλήνα ενός μη ειδικού για κάθε όργανο χυμικού παράγοντα που ευθύνεται για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που σχηματίζουν αποικίες ινοβλαστών αποδεικνύεται από δεδομένα σχετικά με τη διεγερτική τους δράση στις αποικίες σε μονοστοιβάδες καλλιέργειες μυελού των οστών.

Από αυτή την άποψη, αξίζει να σημειωθεί ότι με τη συστηματική χορήγηση πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων, τα παράγωγά τους αναπληρώνουν όχι μόνο τον μυελό των οστών, αλλά και άλλους ιστούς, κάτι που χρησιμοποιείται, ειδικότερα, για γονιδιακή θεραπεία. Έχει αποδειχθεί ότι με ενδοφλέβια χορήγηση μεγάλων ποσοτήτων MSC με γονιδίωμα άγριου τύπου σε ποντίκια με μετάλλαξη στο γονίδιο κολλαγόνου Ι, τα κύτταρα-δότες αντικαθιστούν έως και 30% των κυττάρων στον οστικό και χόνδρινο ιστό των ληπτών, και τα μεταμοσχευμένα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα ποντικού που εκκρίνουν ανθρώπινη IL-3 υποστηρίζουν αποτελεσματικά την αιματοποίηση για 9 μήνες στην περίπτωση ταυτόχρονης χορήγησής τους με ανθρώπινα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Γενετική τροποποίηση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων

Μεταξύ των επιτυχιών της πειραματικής γενετικής τροποποίησης των MSC, αξίζει να σημειωθεί η μεταμόσχευση του γονιδίου του παράγοντα IX σε ανθρώπινα MSC με επακόλουθη μεταφορά μεταμοσχευμένων κυττάρων σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια, η οποία οδηγεί στην εμφάνιση αντιαιμοφιλικού παράγοντα Β στο αίμα για 8 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση. Σε αυτό το πείραμα, πραγματοποιήθηκε μετα-μεταφραστική τροποποίηση του παράγοντα IX από γ-γλουταμυλ καρβοξυλάση στα μεταμοσχευμένα κύτταρα. Η μεταμόσχευση MSC με ρετροϊικό φορέα που κωδικοποιεί ανθρώπινο παράγοντα IX ήταν λιγότερο επιτυχημένη - η επακόλουθη χορήγηση αυτών των κυττάρων σε σκύλο με αιμορροφιλία Β παρείχε ένα θεραπευτικό επίπεδο παράγοντα IX, διατηρώντας την κανονική ένταση της αιμόστασης πήξης, μόνο για 12 ημέρες.

Η μεταμόσχευση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων στο εγκεφαλικό παρέγχυμα ζώων έχει δείξει ότι τα ανώριμα κύτταρα του δότη μετασχηματίζονται τόσο σε νευρωνικούς όσο και σε νευρογλοιακούς πληθυσμούς. Η ενσωμάτωση νευρωνικών παραγώγων από υγιές μεσεγχυματικό ιστό του δότη καθιστά θεωρητικά δυνατή τη διόρθωση γενετικών ανωμαλιών του μεταβολισμού του εγκεφάλου σε ασθενείς με νόσο Gaucher και άλλες διαταραχές του μεταβολισμού των λιπιδίων, των γαγγλιοσιδών ή των υδατανθράκων.

Η πειραματική αναζήτηση συνθηκών για τη διαφοροποίηση των στρωματικών βλαστικών κυττάρων του μυελού των οστών σε προγονικά κύτταρα νευρικού και ηπατικού ιστού βρίσκεται σε εξέλιξη. Η προσοχή των ερευνητών επικεντρώνεται σε συνδυασμούς επαγωγέων διαφοροποίησης και ειδικών ρυθμισμένων μέσων. Συγκεκριμένα, για την απομόνωση της πρωτογενούς καλλιέργειας στρωματικών κυττάρων, κύτταρα μυελού των οστών που πλένονται και επαναιωρούνται σε μέσο καλλιέργειας DMEM/F12 (1/1) με 10% εμβρυϊκό ορό μοσχαριού ενοφθαλμίζονται σε πυκνότητα 200.000/cm2. Μετά από 24 ώρες, τα μη προσκολλημένα κύτταρα αφαιρούνται και τα κύτταρα που μοιάζουν με ινοβλάστες και είναι προσκολλημένα στο πλαστικό καλλιεργούνται για μία εβδομάδα. Για τη διαφοροποίηση των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών σε νευροβλάστες, χρησιμοποιείται ένα προσαρμοσμένο μέσο που λαμβάνεται με τριήμερη καλλιέργεια της πρωτογενούς καλλιέργειας εμβρυϊκών ινοβλαστών ποντικού, καθώς και μέσο DMEM/F12 (1/1) με 2% εμβρυϊκό ορό μόσχου και την προσθήκη 20 ng/ml NF ή 10-6 M ρετινοϊκού οξέος (νευροεπαγωγείς που χρησιμοποιούνται για τη νευρική διαφοροποίηση εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων ποντικού και ανθρώπου). Η διαφοροποίηση των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών σε προδρομικά κύτταρα ηπατοκυττάρων προκαλείται σε ένα προσαρμοσμένο μέσο που δημιουργείται ως αποτέλεσμα τριήμερης καλλιέργειας της πρωτογενούς καλλιέργειας εμβρυϊκών ηπατικών κυττάρων ποντικού σε μέσο DMEM/F12 (1/1) με την προσθήκη 10% εμβρυϊκού ορού μόσχου.

Εδώ θα πρέπει να σημειωθεί για άλλη μια φορά ότι τα κύτταρα που σχηματίζουν αποικίες του στρώματος του μυελού των οστών είναι ετερόμορφα και μπορούν να χωριστούν σε δύο τύπους. Ο πρώτος τύπος περιλαμβάνει ινοβλαστικά κύτταρα που σχηματίζουν φιλοπόδια με μεγάλους πυρήνες και ένα ή δύο πυρηνίσκους. Ο δεύτερος τύπος αντιπροσωπεύεται από μικρά ατρακτοειδή κύτταρα. Κατά την καλλιέργεια κυττάρων και των δύο τύπων σε ένα ρυθμισμένο μέσο που λαμβάνεται σε ένα τροφοδοτικό στρώμα πρωτογενών εμβρυϊκών ινοβλαστών ποντικού, κύτταρα παρόμοια με τους νευροβλάστες εμφανίζονται στην καλλιέργεια την 3η έως 4η ημέρα. Σε αυτό το στάδιο, έχουν συχνότερα ατρακτοειδή μορφή με μία ή δύο μακριές αποφύσεις που καταλήγουν σε φιλοπόδια. Λιγότερο συνηθισμένα είναι τα πυραμιδικά ή αστεροειδή κύτταρα με βραχείς δενδρίτες. Οι δενδρίτες ορισμένων νευροβλαστών έχουν χαρακτηριστικές επεκτάσεις (μπουμπούκια ανάπτυξης) και διακλαδώσεις στο περιφερικό τους τμήμα, ενώ άλλοι έχουν διακριτούς κώνους ανάπτυξης με φιλοπόδια, μέσω των οποίων αναπτύσσονται οι δενδρίτες. Παρόμοια μορφολογικά χαρακτηριστικά (μπουμπούκια και κώνοι ανάπτυξης με φιλοπόδια) που είναι εγγενή στους νευροβλάστες που διαφοροποιούνται σε νευρώνες έχουν περιγραφεί λεπτομερώς σε μελέτες για τη νευρογένεση. Με βάση αυτό, ορισμένοι συγγραφείς καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι τα κύτταρα που βρήκαν στην καλλιέργεια είναι νευροβλάστες. Συγκεκριμένα, η E. Shchegelskaya και οι συν-συγγραφείς (2002) μετά από καλλιέργεια μιας πρωτογενούς καλλιέργειας στρωματικών κυττάρων για δύο εβδομάδες σε ένα ρυθμισμένο μέσο που άλλαζε κάθε 3η έως 4η ημέρα, διαπίστωσαν ότι ορισμένα από τα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν διατηρώντας μια αδιαφοροποίητη κατάσταση. Εξωτερικά, τέτοια κύτταρα έμοιαζαν με ινοβλάστες και ανιχνεύθηκαν στην καλλιέργεια μαζί με διαφοροποιημένους νευροβλάστες. Η πλειονότητα των κυττάρων (περίπου 80%) βρισκόταν σε διαφορετικά στάδια διαφοροποίησης σε κύτταρα του νευρικού ιστού, κυρίως σε νευρώνες. Οι δενδριτικές αποφύσεις αυτών των κυττάρων ήταν σε στενή επαφή μεταξύ τους, έτσι ώστε τα κύτταρα σταδιακά σχημάτισαν τμήματα του νευρικού δικτύου στο υπόστρωμα με τη μορφή μακρών πολυκυτταρικών κλώνων. Οι δενδριτικές αποφύσεις των νευροβλαστών έγιναν σημαντικά μεγαλύτερες, μερικές από αυτές ξεπέρασαν το μήκος του ίδιου του νευρωνικού σώματος κατά 8-10 φορές. Η αναλογία των πυραμιδικών και αστεροειδών κυττάρων αυξήθηκε σταδιακά. Οι δενδρίτες των αστεροειδών κυττάρων διακλαδώθηκαν. Σύμφωνα με τους συγγραφείς, η μεταγενέστερη διαφοροποίηση των πυραμιδικών και αστεροειδών κυττάρων σε σύγκριση με τα ατρακτοειδή κύτταρα αντιστοιχεί στην ακολουθία των σταδίων της φυσιολογικής νευρογένεσης στα ζώα. Ως αποτέλεσμα, οι συγγραφείς καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι τα στρωματικά βλαστοκύτταρα του μυελού των οστών υφίστανται επαγόμενη νευρογένεση, κατά την οποία και οι τρεις κύριοι τύποι νευρώνων σχηματίζονται από νευροβλάστες in vitro. Πρόδρομοι νευρικών κυττάρων ανιχνεύθηκαν επίσης κατά την καλλιέργεια στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών για 3-4 ημέρες σε ένα μέσο με 2% εμβρυϊκό ορό και 20 ng/ml LIF. Αλλά σε αυτή την περίπτωση, τα βλαστοκύτταρα διαιρέθηκαν πολύ αργά, η διαφοροποίηση των νευροβλαστών εμφανίστηκε μόνο στο 30% των περιπτώσεων και δεν σχημάτισαν νευρωνικά δίκτυα. Χρησιμοποιώντας ρετινοϊκό οξύ ως έναν από τους επαγωγείς της διαφοροποίησης των νευρικών κυττάρων, οι συγγραφείς έλαβαν έως και 25-30% των νευρικών κυττάρων στην καλλιέργεια,με κυρίως νευρογλοιακά στοιχεία - αστροκύτταρα και ολιγοδενδροκύτταρα. Οι νευρώνες αποτελούσαν μόνο το ένα τρίτο όλων των νευρικών κυττάρων, αν και αντιπροσωπεύονταν και από τους τρεις τύπους: ατρακτοειδή, πυραμιδικά και αστεροειδή κύτταρα. Την 6η ημέρα καλλιέργειας στρωματικών κυττάρων σε μέσο με ρετινοϊκό οξύ, τα νευρικά κύτταρα διαφοροποιήθηκαν περισσότερο και βρέθηκαν άξονες σε μεμονωμένους πυραμιδικούς νευρώνες, οι οποίοι στην φυσιολογική νευροοντογένεση εμφανίζονται αργότερα από τον σχηματισμό δενδριτικών αποφύσεων. Σύμφωνα με τους συγγραφείς, παρά τη χαμηλή απόδοση νευρικών κυττάρων, η μέθοδος επαγωγής ρετινοϊκού οξέος έχει τα πλεονεκτήματά της: τα ολιγοδενδροκύτταρα και τα αστροκύτταρα εκτελούν μυελινωτικές και θρεπτικές λειτουργίες κατά την ανάπτυξη δενδριτών και αξόνων και είναι απαραίτητα για τον φυσιολογικό σχηματισμό νευρικού ιστού. Επομένως, για την επιδιόρθωση των κατεστραμμένων περιοχών του in vivo, είναι καλύτερο να χρησιμοποιείται ένα εναιώρημα νευρώνων εμπλουτισμένο με νευρογλοιακά κύτταρα.

Στη δεύτερη σειρά πειραμάτων, οι συγγραφείς επιχείρησαν να προκαλέσουν διαφοροποίηση των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών σε ηπατικά κύτταρα. Μετά από τρεις ημέρες καλλιέργειας στρωματικών βλαστικών κυττάρων μυελού των οστών σε ένα προσαρμοσμένο μέσο που ελήφθη με επώαση εμβρυϊκών ηπατοκυττάρων ποντικού, βρέθηκαν μεγάλα, σφαιρικά κύτταρα, συχνά διπύρηνα, με κυτταροπλασματικά εγκλείσματα διαφόρων μεγεθών. Αυτά τα κύτταρα βρίσκονταν σε διαφορετικά στάδια διαφοροποίησης και διέφεραν σε μέγεθος, αριθμό πυρήνων και εγκλείσματα στο κυτταρόπλασμα. Ανιχνεύτηκε γλυκογόνο στα περισσότερα από αυτά τα κύτταρα, βάσει του οποίου οι συγγραφείς τα αναγνώρισαν ως προδρομικά κύτταρα ηπατοκυττάρων. Δεδομένου ότι δεν βρέθηκαν κύτταρα παρόμοια με τους νευροβλάστες στην καλλιέργεια, συνήχθη το συμπέρασμα ότι το προσαρμοσμένο μέσο που ελήφθη ως αποτέλεσμα της καλλιέργειας εμβρυϊκών ηπατοκυττάρων δεν διέθετε παράγοντες διαφοροποίησης των νευρικών κυττάρων και, αντίστροφα, περιείχε παράγοντες που προκαλούν διαφοροποίηση των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών σε προδρομικά κύτταρα ηπατοκυττάρων. Συμπερασματικά, οι συγγραφείς υποδηλώνουν την παρουσία πολυδυναμικότητας στα στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών, καθώς διαφοροποιούνται in vitro σε νευρικά ή ηπατικά κύτταρα ανάλογα με τα συγκεκριμένα προσαρμοσμένα μέσα και τους επαγωγείς που χρησιμοποιήθηκαν.

Ορισμένες μελέτες έχουν πράγματι δείξει σωστά τη διαφοροποίηση των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών σε καρδιομυοκύτταρα, κύτταρα χόνδρου, οστού και νευρικού ιστού. Υπάρχουν ενδείξεις ότι μεταξύ των κυττάρων του μυελού των οστών υπάρχουν πληθυσμοί βλαστοκυττάρων ικανοί να διαφοροποιηθούν σε ηπατοκύτταρα. Υπό το φως αυτών των δεδομένων, τα αποτελέσματα των παραπάνω πειραμάτων σε ποντίκια μπορούν να θεωρηθούν περαιτέρω επιβεβαίωση της παρουσίας στον μυελό των οστών πολυδύναμων μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων ικανών να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα διαφόρων ιστών ενός ενήλικου οργανισμού.

Μεταμόσχευση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων

Στην κλινική μεταμοσχεύση, τα ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να διασφαλιστεί η επέκταση των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων, καθώς και των πρώιμων προ-δεσμευμένων απογόνων τους. Συγκεκριμένα, η εισαγωγή αυτόλογων αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων και MSC σε ασθενείς με καρκίνο μετά από χημειοθεραπεία υψηλής δόσης επιταχύνει την αποκατάσταση του αριθμού των ουδετερόφιλων και των αιμοπεταλίων στο περιφερικό αίμα. Τα αλλο- και αυτόλογα μοσχεύματα μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία του πολλαπλού μυελώματος, της απλαστικής αναιμίας και της αυθόρμητης θρομβοπενίας - ασθενειών που σχετίζονται με ένα πρωτοπαθές ελάττωμα στο στρώμα του αιμοποιητικού ιστού. Η αποτελεσματικότητα της κυτταρικής θεραπείας στην ογκοαιματολογική παθολογία είναι σε πολλές περιπτώσεις υψηλότερη με την ταυτόχρονη εισαγωγή στρωματικών και αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων, η οποία εκδηλώνεται με μείωση της μετεγχειρητικής περιόδου αποκατάστασης της αιματοποίησης, μείωση του αριθμού των θανατηφόρων αποτελεσμάτων λόγω μη επιλεκτικής καταστροφής περιφερειακών και κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων, στα οποία πεθαίνουν και τα ίδια τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα του ασθενούς. Οι προοπτικές χρήσης των MSC και άλλων πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων στην κλινική πράξη οφείλονται στη σχετική ευκολία απόκτησής τους από αναρροφήσεις μυελού των οστών, στην επέκταση σε καλλιέργεια και στη μεταμόσχευση θεραπευτικών γονιδίων. Ταυτόχρονα, η τοπική εμφύτευση πολυδύναμων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αντιστάθμιση τοπικών ελαττωμάτων ιστών και, σε περίπτωση συστηματικών δυσλειτουργιών ιστών μεσεγχυματικής προέλευσης, δεν αποκλείεται η εισαγωγή τους στη γενική κυκλοφορία του αίματος.

Οι συγγραφείς έργων, στα οποία αναλύονται οι προοπτικές χρήσης των MSC για τοπική, συστηματική μεταμόσχευση και γονιδιακή θεραπεία από την άποψη της βιολογίας των στρωματικών κυττάρων, είναι πιο προσεκτικοί στη συλλογιστική τους. Ο μεταγεννητικός μυελός των οστών παραδοσιακά θεωρείται ως ένα όργανο που αποτελείται από δύο κύρια συστήματα σαφώς καθορισμένων κυτταρικών σειρών - τον ίδιο τον αιμοποιητικό ιστό και το υποστηρικτικό στρώμα που σχετίζεται με αυτόν. Επομένως, τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα του μυελού των οστών θεωρούνταν αρχικά αποκλειστικά ως πηγή στρωματικής βάσης για την παραγωγή ρυθμιστικών παραγόντων του αιμοποιητικού μικροπεριβάλλοντος. Στη συνέχεια, η προσοχή των ερευνητών στράφηκε στη μελέτη του ρόλου των MSC ως βλαστικής πηγής σκελετικών ιστών. Τα τελευταία δεδομένα υποδεικνύουν μια απροσδόκητη δυνατότητα διαφοροποίησης των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών με το σχηματισμό νευρικού ή μυϊκού ιστού. Με άλλα λόγια, τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα εμφανίζουν διαγενετική πλαστικότητα - την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε κυτταρικούς τύπους που φαινοτυπικά δεν σχετίζονται με τα κύτταρα του αρχικού ιστού. Ταυτόχρονα, ορισμένες πτυχές της βιολογίας των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών παραμένουν ασαφείς και ανεπίλυτες τόσο σε γενικούς βιολογικούς όρους όσο και σε επιμέρους λεπτομέρειες, συμπεριλαμβανομένης της ταυτοποίησης, της φύσης, της προέλευσης, της ανάπτυξης και της λειτουργίας in vivo των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών, καθώς και του επιτρεπόμενου δυναμικού διαφοροποίησης ex vivo και των δυνατοτήτων θεραπευτικής χρήσης in vivo. Τα δεδομένα που ελήφθησαν σχετικά με το δυναμικό των MSC, καθώς και τα αποτελέσματα μελετών για το αναγεννητικό δυναμικό άλλων βλαστοκυττάρων, έρχονται σε έντονη αντίθεση με τα δόγματα που έχουν καθιερωθεί στη βιολογία.

Όταν καλλιεργούνται σε χαμηλή πυκνότητα, τα στρωματικά βλαστοκύτταρα του μυελού των οστών σχηματίζουν διακριτές αποικίες, καθεμία από τις οποίες προέρχεται από ένα μόνο προγονικό κύτταρο. Το ποσοστό των στρωματικών προγονικών κυττάρων στα πυρηνικά κύτταρα του μυελού των οστών, που καθορίζεται από την ικανότητα σχηματισμού αποικιών, εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό τόσο από τις συνθήκες καλλιέργειας όσο και από τα είδη MSC. Για παράδειγμα, στα τρωκτικά, η παρουσία ακτινοβολημένων τροφοδοτικών κυττάρων μυελού των οστών και ορού στην καλλιέργεια είναι απολύτως απαραίτητη για να ληφθεί ο μέγιστος αριθμός στρωματικών προγονικών κυττάρων, ενώ στους ανθρώπους, η αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικιών των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων είναι ανεξάρτητη τόσο από το τροφοδοτικό όσο και από το μέσο καλλιέργειας. Ο αριθμός των γνωστών μιτογόνων παραγόντων που διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των στρωματικών προγονικών κυττάρων είναι περιορισμένος. Σε αυτούς περιλαμβάνονται οι PDGF, EGF, FGF, TGF-b και IGF1. Υπό βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας, οι πολυκλωνικές σειρές MSC μπορούν να αντέξουν περισσότερες από 50 κυτταρικές διαιρέσεις in vitro, καθιστώντας δυνατή τη λήψη δισεκατομμυρίων στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών από 1 ml του αναρροφήματός τους.

Ωστόσο, ο πληθυσμός των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών είναι ετερογενής, κάτι που εκδηλώνεται τόσο από τη μεταβλητότητα στα μεγέθη των αποικιών, όσο και από τους διαφορετικούς ρυθμούς σχηματισμού τους, καθώς και από μια ποικιλία κυτταρικής μορφολογίας, η οποία καλύπτει το εύρος από ινοβλαστικά ατρακτοειδή έως μεγάλα επίπεδα κύτταρα. Κατά την ανάπτυξη τέτοιων καλλιεργειών, παρατηρείται επίσης φαινοτυπική ετερογένεια μετά από 20 ημέρες. Ορισμένες αποικίες χαρακτηρίζονται από υψηλή έκφραση αλκαλικής φωσφατάσης, άλλες δεν την εκφράζουν καθόλου, και οι αποικίες του τρίτου τύπου είναι θετικές για φωσφατάση στην κεντρική περιοχή και αρνητικές για φωσφατάση στην περιφέρεια. Μεμονωμένες αποικίες σχηματίζουν οζίδια οστικού ιστού (η έναρξη της μεταλλοποίησης της μήτρας σηματοδοτείται με χρώση με κόκκινο αλιζαρίνης ή για ασβέστιο σύμφωνα με το Van Koss). Σε άλλες αποικίες, εμφανίζεται συσσώρευση λίπους, η οποία αναγνωρίζεται με χρώση G με κόκκινο λαδιού. Λιγότερο συχνά, αποικίες μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων σχηματίζουν χόνδρους χρωματισμένους με μπλε της Αλκέας).

Μετά από έκτοπη μεταμόσχευση σε πειραματόζωα, οι πολυκλωνικές σειρές MGK σχηματίζουν έκτοπο οστό με δικτυωτό στρώμα που σχετίζεται με μυελοποίηση και λιποκύτταρα και, λιγότερο συχνά, με χόνδρινο ιστό. Όταν μεταμοσχεύονται μονοκλωνικές σειρές στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών, παρατηρείται χιμαιρισμός σε ορισμένες περιπτώσεις, όπου το de novo οστό αποτελείται από κύτταρα οστικού ιστού, περιέχει στρώμα και λιποκύτταρα προέλευσης δότη, ενώ τα κύτταρα της αιμοποιητικής σειράς και του αγγειακού συστήματος προέρχονται από τον λήπτη.

Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών επιβεβαιώνουν τη βλαστική φύση του στρωματικού προγονικού κυττάρου του μυελού των οστών από το οποίο προήλθε η κλωνική σειρά. Υποδεικνύουν επίσης ότι δεν είναι όλα τα κύτταρα που κλωνοποιούνται σε καλλιέργεια πραγματικά πολυδύναμα βλαστοκύτταρα. Μερικοί ερευνητές πιστεύουν, και συμμεριζόμαστε την άποψή τους, ότι οι πιο αξιόπιστες πληροφορίες σχετικά με το πραγματικό δυναμικό διαφοροποίησης μεμονωμένων κλώνων μπορούν να ληφθούν μόνο in vivo μετά τη μεταμόσχευση και όχι με τον προσδιορισμό του φαινοτύπου των παραγώγων τους in vitro. Η έκφραση σε καλλιέργεια φαινοτυπικών δεικτών οστεο-, χονδρο- ή λιπογένεσης (που προσδιορίζεται από mRNA ή με ιστοχημικές τεχνικές) και ακόμη και η παραγωγή μεταλλοποιημένης μήτρας δεν αντικατοπτρίζουν τον βαθμό πολυδυναμικότητας ενός μεμονωμένου κλώνου in vivo. Επομένως, η ταυτοποίηση βλαστοκυττάρων σε μια ομάδα στρωματικών κυττάρων είναι δυνατή μόνο εκ των υστέρων, υπό τις κατάλληλες συνθήκες μιας βιολογικής δοκιμασίας μεταμόσχευσης. Συγκεκριμένα, η χονδρογένεση παρατηρείται πολύ σπάνια σε ανοιχτά συστήματα μεταμόσχευσης, ενώ ο σχηματισμός χόνδρου είναι κάθε άλλο παρά ασυνήθιστος σε κλειστά συστήματα όπως θάλαμοι διάχυσης ή καλλιέργειες μικρομάζας in vitro στρωματικών κυττάρων, όπου επιτυγχάνεται τοπική χαμηλή τάση οξυγόνου, η οποία προάγει τον σχηματισμό ιστού χόνδρου. Επομένως, ακόμη και η τεχνική μεταμόσχευσης, καθώς και οι μη ειδικές συνθήκες καλλιέργειας in vitro, επηρεάζουν σημαντικά το εύρος της διαφοροποίησης των MSC.

Η πειραματική μεταμόσχευση υπό καθορισμένες πειραματικές συνθήκες αποτελεί το χρυσό πρότυπο για τον προσδιορισμό του δυναμικού διαφοροποίησης των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών και ένα βασικό στοιχείο στην αναγνώρισή τους. Ιστορικά, οι μελέτες σχετικά με τη μεταμόσχευση στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών συνδέονται με το γενικό πρόβλημα της μεταμόσχευσης μυελού των οστών. Έχει διαπιστωθεί ότι το αιμοποιητικό μικροπεριβάλλον δημιουργείται με τη μεταμόσχευση στρωματικών κυτταρικών σειρών μυελού των οστών και παρέχει έκτοπη ανάπτυξη αιμοποιητικού ιστού στη ζώνη μεταμόσχευσης. Η προέλευση του μικροπεριβάλλοντος από τον δότη και του αιμοποιητικού ιστού από τον ξενιστή μας επιτρέπει να θεωρήσουμε το έκτοπο οστό ως μια πραγματική «ανεστραμμένη» μεταμόσχευση μυελού των οστών. Η τοπική μεταμόσχευση στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών προάγει την αποτελεσματική διόρθωση των οστικών ελαττωμάτων, πιο έντονη από ό,τι με την αυθόρμητη επανορθωτική αναγέννηση. Αρκετές προκλινικές μελέτες σε πειραματικά μοντέλα έχουν καταδείξει πειστικά τη δυνατότητα χρήσης μεταμοσχεύσεων στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών στην ορθοπεδική, αν και απαιτείται η πιο προσεκτική εργασία και ανάλυση για τη βελτιστοποίηση αυτών των μεθόδων, ακόμη και στις πιο απλές περιπτώσεις. Συγκεκριμένα, οι βέλτιστες συνθήκες για την επέκταση των οστεογενετικών στρωματικών κυττάρων ex vivo δεν έχουν ακόμη καθοριστεί, η δομή και η σύνθεση του ιδανικού φορέα, καθώς και ο αριθμός των κυττάρων που είναι απαραίτητα για την ογκομετρική αναγέννηση των οστών, παραμένουν μη ανεπτυγμένες.

Εκτός από τη χρήση ex vivo επεκταμένων στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών για την αναγέννηση ιστών μεσεγχυματικής προέλευσης, η ανορθόδοξη πλαστικότητα των MSC ανοίγει πιθανές εφαρμογές για την αναγέννηση νευρικών κυττάρων ή την παροχή γονιδιακών προϊόντων στο ΚΝΣ. Κατ' αρχήν, αυτό απλοποιεί την κυτταρική θεραπεία για βλάβες του νευρικού συστήματος, καθώς δεν υπάρχει ανάγκη λήψης αυτόλογων ανθρώπινων νευρικών βλαστοκυττάρων. Έχουν αναφερθεί πιθανές εφαρμογές κυττάρων μυελού των οστών για την παραγωγή καρδιομυοκυττάρων και μυογενών προγονικών κυττάρων τόσο πραγματικής στρωματικής όσο και εξωστρωματικής προέλευσης.

Διεξάγονται πειράματα σχετικά με τη συστηματική μεταμόσχευση στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών για τη θεραπεία κοινών σκελετικών παθήσεων. Δεν υπάρχει αμφιβολία ότι τα στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών αποτελούν τον πληθυσμό που ευθύνεται για γενετικές διαταραχές στις σκελετικές παθήσεις, κάτι που καταδεικνύεται καλά από τη μεταφορά γενετικών πληροφοριών μέσω φορέων χρησιμοποιώντας αυτά τα κύτταρα, η οποία οδηγεί στο σχηματισμό παθολογικού οστικού ιστού σε πειραματόζωα. Ωστόσο, η ικανότητα των στρωματικών κυττάρων να εμφυτεύονται, να εμφυτεύονται, να πολλαπλασιάζονται και να διαφοροποιούνται στα σκελετικά οστά μετά την εισαγωγή τους στη γενική κυκλοφορία του αίματος δεν έχει ακόμη αποδειχθεί.

Αυτό οφείλεται εν μέρει στο γεγονός ότι στην τυπική μεταμόσχευση μυελού των οστών το στρώμα δεν μεταμοσχεύεται μαζί με τον αιμοποιητικό ιστό, επομένως δεν έχουν ακόμη αναπτυχθεί αυστηρά κριτήρια για την αξιολόγηση της επιτυχούς ενσωμάτωσης συστηματικά χορηγούμενων στρωματικών κυττάρων. Θα πρέπει να θυμόμαστε ότι η παρουσία γονιδίων-δεικτών σε εκχυλίσματα ιστών ή η απομόνωση κυττάρων δότριας προέλευσης σε καλλιέργεια δεν υποδηλώνει ενσωμάτωση των κυττάρων, αλλά μόνο την επιβίωσή τους. Ακόμη και η ενδοαρτηριακή έγχυση στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών σε άκρο ποντικού μπορεί να οδηγήσει σε ουσιαστικά μηδενική ενσωμάτωση, παρά το γεγονός ότι κύτταρα δότριας προέλευσης βρίσκονται σε μεγάλους αριθμούς εντός της μικροαγγείωσης του μυελού των οστών. Δυστυχώς, τέτοια κύτταρα συνήθως περιγράφονται ως «εμφυτευμένα» απλώς με βάση την ανίχνευση γονιδίων-δεικτών για κύτταρα δότριας σε καλλιέργεια ex vivo. Επιπλέον, πρέπει να παρέχονται πειστικά στοιχεία για τη μακροπρόθεσμη ενσωμάτωση διαφοροποιημένων και λειτουργικά ενεργών κυττάρων δότριας προέλευσης στους υπό μελέτη ιστούς. Σε πολλές δημοσιευμένες εργασίες που αναφέρουν την ενσωμάτωση στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών στον σκελετό, η απουσία σαφών δεδομένων αυτού του είδους είναι εντυπωσιακή. Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι ορισμένα σωστά πειράματα σε ζώα έχουν πράγματι διαπιστώσει μια περιορισμένη αλλά πραγματική ενσωμάτωση στρωματικών προγονικών κυττάρων μετά τη συστηματική χορήγησή τους.

Αυτά τα δεδομένα συμφωνούν με τα αποτελέσματα μελετών σχετικά με τη δυνατότητα μεταφοράς μυογενών προγονικών κυττάρων μυελού των οστών στους μύες μέσω του αγγειακού συστήματος. Ωστόσο, δεν πρέπει να ξεχνάμε ότι τόσο ο σκελετικός όσο και ο μυϊκός ιστός σχηματίζονται κατά την ανάπτυξη και την ανάπτυξη με βάση εξωαγγειακές κινήσεις κυττάρων που χρησιμοποιούν διαδικασίες μετανάστευσης που δεν περιλαμβάνουν κυκλοφορία του αίματος. Εάν υπάρχει μια ανεξάρτητη κυκλοφορική οδός για τη μεταφορά προγονικών κυττάρων σε ιστούς στερεάς φάσης, είναι δυνατόν να υποθέσουμε την ύπαρξη φυσιολογικά κυκλοφορούντων μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων; Ποια είναι η προέλευση αυτών των κυττάρων τόσο στον αναπτυσσόμενο όσο και στον μεταγεννητικό οργανισμό και πώς διεισδύουν στο αγγειακό τοίχωμα; Η απάντηση σε αυτά τα ερωτήματα φαίνεται απολύτως απαραίτητη και απαιτεί την πιο προσεκτική προκλινική ανάλυση. Ακόμα και μετά την εύρεση απαντήσεων σε αυτά τα ερωτήματα, οι προβληματικές κινητικές πτυχές που σχετίζονται με την ανάπτυξη του σκελετού και την αναδιαμόρφωση του συνδετικού ιστού θα παραμείνουν άλυτες. Ταυτόχρονα, η θεραπεία των διαταραχών οστεογένεσης με την αντικατάσταση ολόκληρου του πληθυσμού μεταλλαγμένων σκελετικών προγονικών κυττάρων με υγιή στρωματικά στοιχεία φαίνεται να είναι μια πραγματική κλινική προοπτική. Σε αυτή την περίπτωση, οι τοπικές ζώνες καταγμάτων ή οι παραμορφώσεις που οφείλονται σε παθολογική οστεογένεση, καθώς και οι καταστροφικές αλλαγές στον οστικό ιστό, μπορούν να διορθωθούν χρησιμοποιώντας στρωματικά βλαστοκύτταρα που καλλιεργούνται in vitro. Συνεπώς, είναι σκόπιμο να επικεντρωθεί η μελλοντική έρευνα στα προβλήματα του μετασχηματισμού ή της γενετικής διόρθωσης αυτόλογων μεταλλαγμένων οστεογενετικών προγονικών κυττάρων ex vivo.

Η γενετική μηχανική των κυττάρων, βραχυπρόθεσμη ή μόνιμη, έχει γίνει η βάση της κυτταρικής και μοριακής βιολογίας, η πηγή πολλών επιστημονικών ανακαλύψεων σχετικά με τον ρόλο των μεμονωμένων πρωτεϊνών στον κυτταρικό μεταβολισμό in vitro και in vivo. Η χρήση μοριακών τεχνολογιών για τη διόρθωση κληρονομικών παθολογιών και ανθρώπινων ασθενειών είναι πολύ ελπιδοφόρα για την πρακτική ιατρική, καθώς οι ιδιότητες των στρωματικών βλαστοκυττάρων του μυελού των οστών καθιστούν δυνατή την ανάπτυξη μοναδικών σχημάτων μεταμόσχευσης για τη διόρθωση γενετικών ασθενειών του σκελετού. Ταυτόχρονα, τα μεσεγχυματικά πρόδρομα κύτταρα μπορούν εύκολα να ληφθούν από τον μελλοντικό λήπτη, είναι επιδεκτικά γενετικού χειρισμού και είναι ικανά να πολλαπλασιαστούν σε μεγάλες ποσότητες σε σύντομο χρονικό διάστημα. Η χρήση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων επιτρέπει την αποφυγή των περιορισμών και των κινδύνων που σχετίζονται με την παροχή γενετικού πληροφοριακού υλικού απευθείας στον ασθενή μέσω ενδοαγγειακών κατασκευών φορέα. Μια παρόμοια στρατηγική εφαρμόζεται και στα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα, αλλά τα αυτόλογα μεταγεννητικά στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών είναι ένα προτιμότερο υλικό, καθώς η εισαγωγή τους αποκλείει πιθανές ανοσολογικές επιπλοκές μετά τη μεταμόσχευση. Για να επιτευχθεί βραχυπρόθεσμο αποτέλεσμα, για παράδειγμα, για την επιτάχυνση της αναγέννησης των οστών, η βέλτιστη μέθοδος είναι η γενετική τροποποίηση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων χρησιμοποιώντας ηλεκτροπόρωση, χημική σύντηξη, λιπομόλυνση, πλασμίδια και αδενοϊικά κατασκευάσματα. Συγκεκριμένα, η ιική μεταμόσχευση σε στρωματικά κύτταρα μυελού των οστών BMP-2 έχει αποδειχθεί αποτελεσματική στην επιτάχυνση της αναγέννησης των οστών σε πειραματικά πολυτραύματα. Η δημιουργία αδενοϊικών κατασκευών φορέα είναι προτιμότερη λόγω της απουσίας τοξικότητας. Ωστόσο, η γενετική τροποποίηση στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών σε αυτή την περίπτωση χαρακτηρίζεται από εξαιρετικά χαμηλή σταθερότητα. Επιπλέον, τα φυσιολογικά μετασχηματισμένα στρωματικά κύτταρα μυελού των οστών απαιτούν τη χρήση φορέων γενετικών πληροφοριών που είναι 10 φορές πιο μολυσματικοί από άλλους τύπους κυττάρων, γεγονός που αυξάνει σημαντικά το ποσοστό θανάτου των μεταμοσχευμένων κυττάρων.

Η θεραπεία υπολειπόμενων ασθενειών που προκαλούνται από χαμηλή ή μηδενική βιολογική δραστηριότητα ορισμένων γονιδίων απαιτεί μακροχρόνια ή μόνιμη τροποποίηση των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων, η οποία απαιτεί τη χρήση αδενο-σχετιζόμενων ιών, ρετροϊών, φακοϊών ή αδενο-ρετροϊικών χιμαιρών. Οι περιοχές μεταφοράς αυτών των ιών είναι ικανές να μεταφέρουν μεγάλα DNA transfects (έως 8 kb). Η επιστημονική βιβλιογραφία έχει ήδη αναφερθεί στην εξωγενή βιολογική δραστηριότητα των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών που έχουν μεταμοσχευθεί με ρετροϊικά κατασκευάσματα που κωδικοποιούν τη σύνθεση ρυθμιστικών και δεικτικών μορίων - IL-3, CD2, παράγοντα VIII, καθώς και ένζυμα που εμπλέκονται στη σύνθεση του L-DOPA. Ωστόσο, ακόμη και σε αυτές τις μελέτες, οι συγγραφείς επισημαίνουν μια σειρά από περιορισμούς που πρέπει να ξεπεραστούν πριν από την πρακτική εφαρμογή αυτής της τεχνολογίας. Το πρώτο πρόβλημα είναι η βελτιστοποίηση της διαδικασίας τροποποίησης των MSC ex vivo. Είναι γνωστό ότι ο μακροχρόνιος (3-4 εβδομάδες) πολλαπλασιασμός των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών in vitro μειώνει τη μεταμόλυνσή τους. Ταυτόχρονα, για να επιτευχθεί υψηλό επίπεδο γενετικής τροποποίησης των MSC, είναι απαραίτητο να πραγματοποιηθούν αρκετοί κύκλοι μεταμόσχευσης. Το δεύτερο πρόβλημα σχετίζεται με τη διάρκεια της θεραπευτικής γονιδιακής έκφρασης, η οποία δεν υπερβαίνει ακόμη τους τέσσερις μήνες. Μια φυσική μείωση στην αποτελεσματική γονιδιακή έκφραση οφείλεται στην απενεργοποίηση του υποκινητή και στον θάνατο των τροποποιημένων κυττάρων. Με τις γενικές προοπτικές μεταφοράς γενετικών πληροφοριών χρησιμοποιώντας μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα, τα αποτελέσματα προκαταρκτικών μελετών υποδεικνύουν την ανάγκη για περαιτέρω βελτιστοποίηση των μεθόδων μεταμόσχευσης ex vivo, την επιλογή ενός επαρκούς υποκινητή που ρυθμίζει τη βιολογική δραστηριότητα προς την επιθυμητή κατεύθυνση και την αύξηση της ικανότητας των τροποποιημένων στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών να αυτοσυντηρούνται in vivo μετά τη μεταμόσχευση. Πρέπει να σημειωθεί ότι η χρήση ρετροϊικών κατασκευών για την τροποποίηση των στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών προς την επιθυμητή κατεύθυνση δεν απαιτεί πάντα την υποχρεωτική εμφύτευσή τους. Τα μεταμοσχευμένα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα μπορούν να εκτελέσουν μια διορθωτική λειτουργία στο πλαίσιο της σταθερής παραμονής και χωρίς υποχρεωτική ενεργή φυσική ενσωμάτωση και λειτουργία στον συνδετικό ιστό. Σε αυτή την περίπτωση, θα πρέπει να θεωρηθούν ως μια βιολογική μίνι-αντλία που παράγει in vivo έναν παράγοντα, η ανεπάρκεια του οποίου καθορίζει την εκδήλωση γενετικής παθολογίας.

Η χρήση μετασχηματισμένων στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών για τη θεραπεία της κυρίαρχης γενετικής παθολογίας, η οποία χαρακτηρίζεται από την έκφραση ενός γονιδίου με παθολογική ή ανώμαλη βιολογική δραστηριότητα, είναι πολύ πιο προβληματική, καθώς σε αυτή την περίπτωση είναι απαραίτητο να αποκλειστεί η μεταφορά ή η εφαρμογή παραμορφωμένων γενετικών πληροφοριών. Μία από τις μεθόδους της γενετικής μηχανικής είναι ο ομόλογος ανασυνδυασμός εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων με σκοπό τη δημιουργία διαγονιδιακών ζώων. Ωστόσο, ο εξαιρετικά χαμηλός βαθμός ομόλογου ανασυνδυασμού σε συνδυασμό με τα προβλήματα ταυτοποίησης, διαχωρισμού και επέκτασης τέτοιων ανασυνδυασμένων κυττάρων είναι απίθανο να συμβάλει στην ευρεία χρήση αυτής της μεθόδου στο εγγύς μέλλον, ακόμη και αν αναπτυχθούν νέες τεχνολογικές μέθοδοι. Η δεύτερη προσέγγιση στη γονιδιακή θεραπεία της κυρίαρχης παθολογίας βασίζεται στην αυτόματη διόρθωση του κατεστραμμένου DNA, καθώς οι γενετικές μεταλλάξεις μπορούν να διορθωθούν με την εισαγωγή εξωγενούς DNA με την επιθυμητή αλληλουχία (μικρά ολιγονουκλεοτίδια DNA ή χιμαιρικά ολιγονουκλεοτίδια RNA/DNA), το οποίο συνδέεται με ομόλογα στο κατεστραμμένο γονιδίωμα. Η τρίτη επιλογή περιλαμβάνει τον αποκλεισμό της μετάδοσης παθολογικών πληροφοριών, η οποία επιτυγχάνεται μέσω της χρήσης ειδικά σχεδιασμένων ολιγονουκλεοτιδίων που συνδέονται με ένα συγκεκριμένο γονίδιο για να σχηματίσουν μια τριαδική ελικοειδή δομή που εξαλείφει την πιθανότητα μεταγραφής.

Αν και η διόρθωση μιας γενετικής ασθένειας σε επίπεδο γονιδιώματος παραμένει η πιο βέλτιστη και προτιμώμενη θεραπευτική μέθοδος, το mRNA είναι επίσης ένας πολλά υποσχόμενος φορέας (πιθανώς ακόμη πιο προσιτός) για τον αποκλεισμό ενός κυρίαρχου αρνητικού γονιδίου. Πρωτεϊνικά μόρια με αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια ή πλήρεις αλληλουχίες που εμποδίζουν τη σύνδεση του mRNA με τον κυτταρικό βιοσυνθετικό μηχανισμό έχουν χρησιμοποιηθεί από καιρό για την αναστολή της μετάφρασης ή/και την αύξηση της αποικοδόμησης του mRNA. Επιπλέον, το δίκλωνο RNA προκαλεί ταχεία αποικοδόμηση του mRNA, ο μηχανισμός της οποίας παραμένει ασαφής. Ωστόσο, είναι απίθανο η απλή εξάλειψη των mRNA που μεταγράφονται από ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο με σύντομες ή μονές μεταλλάξεις να προάγει την έκφραση του mRNA του φυσιολογικού αλληλόμορφου. Μια εναλλακτική λύση είναι η χρήση ριβοσυνθέσεων σφυροκέφαλου και φουρκέτας, οι οποίες έχουν την ικανότητα να συνδέονται με εξαιρετικά εξειδικευμένες περιοχές του mRNA με επακόλουθη επαγωγή της διάσπασης και της απενεργοποίησής τους κατά τη μετάφραση. Η δυνατότητα χρήσης αυτής της μεθόδου στη θεραπεία της παθολογικής οστεογένεσης μελετάται επί του παρόντος. Ανεξάρτητα από το ποιος ακριβώς είναι ο στόχος - γονιδιωματικά ή κυτταροπλασματικά στοιχεία, η επιτυχία των νέων τεχνολογιών γονιδιακής θεραπείας θα καθοριστεί από την αποτελεσματικότητα της ένταξης αντιδραστηρίων σε στρωματικά κύτταρα μυελού των οστών ex vivo, τη βέλτιστη επιλογή ενός συγκεκριμένου φορέα και τη σταθερή ικανότητα των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων να εκφράζουν τους απαραίτητους παράγοντες in vivo.

Έτσι, η ανακάλυψη των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων με τις απροσδόκητες ιδιότητές τους δημιουργεί ένα νέο εννοιολογικό σχήμα για την ανάπτυξη κυτταρικών σειρών. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω διεπιστημονική έρευνα για την κατανόηση του βιολογικού ρόλου των στρωματικών βλαστοκυττάρων, της φύσης τους, της ικανότητάς τους να διαφοροποιούνται ή να αποδιαφοροποιούνται, της φυσιολογικής τους σημασίας κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, τη μεταγεννητική ανάπτυξη, την ωρίμανση και τη γήρανση, καθώς και στις ανθρώπινες ασθένειες.