Αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα από αίμα ομφάλιου λώρου

Το αίμα του ομφάλιου λώρου αποτελεί καλή πηγή αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων όσον αφορά το πολλαπλασιαστικό δυναμικό και τις ικανότητες ανασύστασης των αιμοποιητικών κυττάρων. Έχει επανειλημμένα αποδειχθεί ότι μέχρι τη στιγμή της γέννησης, το αίμα του ομφάλιου λώρου περιέχει έναν αρκετά μεγάλο αριθμό ασθενώς δεσμευμένων αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων. Μερικοί συγγραφείς πιστεύουν ότι το πλεονέκτημα της μεταμόσχευσης αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων από αίμα του ομφάλιου λώρου είναι η έλλειψη ανάγκης αναζήτησης δότη συμβατού με αντιγόνα HLA. Κατά τη γνώμη τους, η ανωριμότητα του ανοσοποιητικού συστήματος του νεογνού προκαλεί μειωμένη λειτουργική δραστηριότητα των ανοσοεπαρκών κυττάρων και, κατά συνέπεια, χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης σοβαρής νόσου μοσχεύματος έναντι ξενιστή σε σχέση με τη μεταμόσχευση μυελού των οστών. Ταυτόχρονα, το ποσοστό επιβίωσης μιας μεταμόσχευσης κυττάρων αίματος του ομφάλιου λώρου δεν είναι χαμηλότερο από αυτό των κυττάρων του μυελού των οστών, ακόμη και στην περίπτωση χρήσης μικρότερου αριθμού αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (HSCs) που χορηγούνται ανά 1 kg σωματικού βάρους του ασθενούς. Ωστόσο, κατά τη γνώμη μας, τα ζητήματα του βέλτιστου αριθμού μεταμοσχευμένων κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος που απαιτούνται για την αποτελεσματική ενσωμάτωση στο σώμα του λήπτη, η ανοσολογική τους συμβατότητα και ορισμένες άλλες πτυχές του προβλήματος της μεταμόσχευσης αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος απαιτούν πιο σοβαρή ανάλυση.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Λήψη αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων από αίμα ομφάλιου λώρου

Η διαδικασία λήψης αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων από το αίμα του ομφάλιου λώρου απαιτεί τη συλλογή του αμέσως μετά τη γέννηση του παιδιού και τον διαχωρισμό του από τον πλακούντα όταν ο πλακούντας βρίσκεται στη μήτρα ή εκτός μήτρας, καθώς και κατά τη διάρκεια καισαρικής τομής, αλλά και εκτός μήτρας. Έχει αποδειχθεί ότι εάν ο χρόνος από τη στιγμή της γέννησης έως τον διαχωρισμό του νεογνού από τον πλακούντα μειωθεί σε 30 δευτερόλεπτα, ο όγκος του λαμβανόμενου αίματος από τον ομφάλιο λώρο αυξάνεται κατά μέσο όρο 25-40 ml. Εάν αυτή η διαδικασία πραγματοποιηθεί αργότερα, χάνεται η ίδια ποσότητα αίματος. Έχει διαπιστωθεί ότι ο πρόωρος διαχωρισμός του παιδιού από τον πλακούντα δεν συνεπάγεται καμία αρνητική συνέπεια για το νεογνό.

Το Ρωσικό Ινστιτούτο Ερευνών Αιματολογίας και Μεταγγίσεων έχει αναπτύξει αποτελεσματικές και χαμηλού κόστους τεχνολογίες για τη λήψη αίματος από τον ομφάλιο λώρο τόσο κατά τη διάρκεια του φυσιολογικού τοκετού ((70,2+25,8) ml) όσο και κατά τη διάρκεια καισαρικής τομής ((73,4+25,1) ml). Έχει προταθεί μια μέθοδος διαχωρισμού του αίματος από τον ομφάλιο λώρο με επαρκώς υψηλή απόδοση πυρηνοκυττάρων και μονοπύρηνων κυττάρων - (83,1+9,6) και (83,4+14,1)%, αντίστοιχα. Έχει βελτιωθεί μια μέθοδος κρυοσυντήρησης του αίματος από τον ομφάλιο λώρο, η οποία εξασφαλίζει υψηλή διατήρηση των μονοπύρηνων κυττάρων και των CFU-GM - (96,8+5,7) και (89,6+22,6)%, αντίστοιχα. Έχει προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα της μεθόδου αποστράγγισης για τη συλλογή αίματος από τον ομφάλιο λώρο χρησιμοποιώντας το δοχείο Kompoplast-300 (Ρωσία). Οι συγγραφείς συνέλεξαν αίμα από τον ομφάλιο λώρο αμέσως μετά τη γέννηση του παιδιού και τον διαχωρισμό του από τον πλακούντα, σε συνθήκες τοποθέτησης του πλακούντα στη μήτρα ή εκτός μήτρας. Πριν από την παρακέντηση της ομφαλικής φλέβας, ο ομφάλιος λώρος υποβλήθηκε σε επεξεργασία μία φορά με βάμμα ιωδίου 5% και στη συνέχεια δύο φορές με αιθυλική αλκοόλη 70%. Το αίμα ρέει αυθόρμητα μέσω των συνδετικών σωλήνων στο δοχείο. Η διαδικασία συλλογής δεν διήρκεσε περισσότερο από 10 λεπτά. Ο μέσος όγκος 66 δειγμάτων αίματος ομφάλιου λώρου που συλλέχθηκαν με παροχέτευση ήταν (72+28) ml και ο αριθμός των λευκοκυττάρων στον μέσο συνολικό όγκο του δείγματος ήταν (1,1+0,6) x 107. Κατά την ανάλυση του αίματος ομφάλιου λώρου για στειρότητα (βακτηριακή μόλυνση, HIV-1, ιοί ηπατίτιδας Β και C, σύφιλη και λοίμωξη από κυτταρομεγαλοϊό), ανιχνεύθηκαν αντισώματα IgG κατά του ιού της ηπατίτιδας C μόνο σε ένα δείγμα. Σε μια άλλη μελέτη, ο πλακούντας τοποθετήθηκε εμβρυϊκά σε ειδικό πλαίσιο αμέσως μετά τη γέννηση, ο ομφάλιος λώρος υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάλυμα ιωδίου 5% και αιθυλική αλκοόλη 75%. Η ομφαλική φλέβα παροχετεύτηκε χρησιμοποιώντας βελόνα από σύστημα μετάγγισης (G16). Το αίμα ρέει αυθόρμητα στο δοχείο. Ο μέσος όγκος αίματος που συλλέχθηκε με αυτόν τον τρόπο ήταν (55+25) ml. Στην εργασία των G. Kogler et al. (1996), το αίμα από τον ομφάλιο λώρο συλλέχθηκε με κλειστή μέθοδο και ελήφθησαν μεγάλοι όγκοι αίματος - κατά μέσο όρο (79+26) ml. Οι συγγραφείς σημειώνουν ότι μεταξύ 574 δειγμάτων αίματος από τον ομφάλιο λώρο, περίπου το 7% περιείχε λιγότερα από 40 ml αίματος, γεγονός που δεν επιτρέπει τη χρήση τους για μεταμόσχευση. Οι K. Isoyama et al. (1996), συλλέγοντας αίμα από τον ομφάλιο λώρο με ενεργητική έκχυση χρησιμοποιώντας σύριγγες, έλαβαν κατά μέσο όρο 69,1 ml αίματος (ο όγκος του αίματος από τον ομφάλιο λώρο κυμαινόταν από 15 έως 135 ml). Τέλος, οι A. Abdel-Mageed PI et al. (1997) κατάφεραν να λάβουν κατά μέσο όρο 94 ml αίματος από τον ομφάλιο λώρο (από 56 έως 143 ml) μέσω καθετηριασμού της ομφαλικής φλέβας.

Για τη μείωση του κινδύνου ιατρογενούς μόλυνσης και μόλυνσης με μητρικές εκκρίσεις, έχει αναπτυχθεί ένα κλειστό σύστημα συλλογής αίματος βασισμένο στο ευρέως χρησιμοποιούμενο σύστημα μετάγγισης της Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (ΗΠΑ), που περιέχει 62,5 ml CPDA (κιτρικό-φωσφορικό-δεξτρόζη με αδενίνη) ως αντιπηκτικό. Η τεχνολογία για τη λήψη του υλικού είναι πρωταρχικής σημασίας για την παρασκευή ενός δείγματος υψηλής ποιότητας όσον αφορά τον όγκο, την περιεκτικότητα και την καθαρότητα του κυτταρικού εναιωρήματος. Από τις υπάρχουσες μεθόδους συλλογής αίματος ομφάλιου λώρου, οι οποίες συμβατικά ταξινομούνται σε κλειστά, ημι-ανοιχτά και ανοιχτά συστήματα, θα πρέπει να προτιμάται η πρώτη, καθώς το κλειστό σύστημα μειώνει σημαντικά τον κίνδυνο μικροβιακής μόλυνσης του υλικού, καθώς και μόλυνσης του κυτταρικού εναιωρήματος με μητρικά κύτταρα.

Οι A. Nagler et al. (1998) διεξήγαγαν μια συγκριτική ανάλυση της αποτελεσματικότητας και των τριών συστημάτων συλλογής αίματος από τον ομφάλιο λώρο. Στην πρώτη παραλλαγή, η διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε κλειστό σύστημα με απολέπιση του αίματος απευθείας σε ένα δοχείο. Στη δεύτερη παραλλαγή, το αίμα από τον ομφάλιο λώρο ελήφθη με ενεργητική έκχυση αίματος με σύριγγα MP1 ακολουθούμενη από έκπλυση των πλακουντιακών φλεβών και ταυτόχρονη παροχέτευση αίματος σε ένα δοχείο (ανοιχτή μέθοδος). Στην τρίτη παραλλαγή, το αίμα συλλέχθηκε σε ημι-ανοιχτό σύστημα με ενεργητική εξαγωγή του με σύριγγες και έκπλυση μέσω της ομφαλικής αρτηρίας με ταυτόχρονη έκχυση σε ένα δοχείο. Στην πρώτη παραλλαγή, οι συγγραφείς έλαβαν αίμα από τον ομφάλιο λώρο σε όγκο (76,4+32,1) ml με περιεκτικότητα σε λευκοκύτταρα (10,5+3,6) x 106 ^σε 1 ml αίματος. Στη δεύτερη παραλλαγή, οι αντίστοιχοι δείκτες ήταν (174,4+42,8) ml και (8,8+3,4) x 106 ^/ ml. στο τρίτο - (173,7+41,3) ml και (9,3+3,8) x 106 ^/ ml. Η πιο συχνή μόλυνση δειγμάτων αίματος από τον ομφάλιο λώρο παρατηρήθηκε κατά τη χρήση ανοιχτού συστήματος. Διαπιστώθηκε άμεση συσχέτιση μεταξύ της μάζας του πλακούντα και του όγκου του αίματος που εξήχθη - με την αύξηση της μάζας του πλακούντα, αυξάνεται και η ποσότητα του συλλεγόμενου αίματος.

Μετά τη συλλογή του ομφαλοπλακουντιακού αίματος, ακολουθεί το στάδιο διαχωρισμού - απομόνωση των μονοπύρηνων κυττάρων και καθαρισμός του κυτταρικού εναιωρήματος από τα ερυθροκύτταρα. Σε πειραματικές συνθήκες, τα εμπύρηνα κύτταρα απομονώνονται με καθίζηση με μεθυλοκυτταρίνη κατά τη διάρκεια της λύσης των ερυθροκυττάρων με χλωριούχο αμμώνιο. Ωστόσο, η μεθυλοκυτταρίνη δεν πρέπει να χρησιμοποιείται για κλινικούς σκοπούς, καθώς οι απώλειες αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων σε αυτήν φτάνουν το 50-90%. Η λύση των ερυθροκυττάρων επίσης σχεδόν ποτέ δεν πραγματοποιείται στην κλινική λόγω των μεγάλων όγκων του διαλύματος εργασίας, αν και το ποσοστό απομόνωσης των εμπύρηνων κυττάρων με φαινότυπο CD34+, καθώς και των προγονικών κυττάρων με τις λειτουργίες CFU-GM και CFU-GEMM με αυτόν τον τρόπο είναι σημαντικά υψηλότερο. Αναφέρεται η εμφάνιση ενός νέου μέσου για την απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων σε μια βαθμίδα πυκνότητας, το διάλυμα buyant density solution (BDS72). Αυτή η ουσία έχει τις ακόλουθες φυσιολογικές παραμέτρους: pH - 7,4, οσμωτικότητα - 280 mOsm/kg, πυκνότητα - 1,0720 g/ml. Σύμφωνα με τους συγγραφείς, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση έως και 100% των CD34-θετικών κυττάρων και την αφαίρεση του 98% των ερυθροκυττάρων. Ωστόσο, το BDS72 δεν χρησιμοποιείται ακόμη στην κλινική πράξη.

Στις εγκεκριμένες μεθόδους απομόνωσης πυρηνοποιημένων κυττάρων από το αίμα του ομφάλιου λώρου, συνήθως χρησιμοποιείται διάλυμα υδροξυαιθυλαμύλου 10% ή διάλυμα ζελατίνης 3%. Η αποτελεσματικότητα της καθίζησης των ερυθροκυττάρων και της απομόνωσης των πυρηνοποιημένων κυττάρων και στις δύο περιπτώσεις είναι περίπου ίση. Ωστόσο, όταν η ζελατίνη χρησιμοποιείται ως παράγοντας καθίζησης, είναι δυνατό να ληφθεί ελαφρώς μεγαλύτερη ποσότητα CFU-GM από ό,τι όταν χρησιμοποιείται υδροξυαιθυλαμύλο. Υποτίθεται ότι οι διαφορές στην αποτελεσματικότητα της απομόνωσης CFU-GM οφείλονται σε διαφορετικούς ρυθμούς καθίζησης μεμονωμένων κλασμάτων πυρηνοποιημένων κυττάρων ή στην ικανότητα των μορίων υδροξυαιθυλαμύλου να απορροφώνται στην επιφάνεια των υποδοχέων των αιμοποιητικών κυττάρων και έτσι να μπλοκάρουν την ευαισθησία τους σε παράγοντες διέγερσης αποικιών που χρησιμοποιούνται στην καλλιέργεια CFU-GM in vitro. Παρ 'όλα αυτά, και οι δύο καθιζητήρες μπορεί να είναι κατάλληλοι για την απομόνωση πυρηνοποιημένων κυττάρων κατά τη δημιουργία τραπεζών αίματος ομφάλιου λώρου μεγάλης κλίμακας.

Οι μέθοδοι διαχωρισμού και κρυοσυντήρησης του ομφαλοπλακουντιακού αίματος ουσιαστικά δεν διαφέρουν από εκείνες που χρησιμοποιούνται στην εργασία με αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα περιφερικού αίματος και μυελού των οστών ενήλικων δοτών. Αλλά κατά την προετοιμασία μεγάλου αριθμού δειγμάτων ομφαλοπλακουντιακού αίματος για τις τράπεζες του, οι μέθοδοι διαχωρισμού πρέπει, πρώτα απ 'όλα, να είναι χαμηλού κόστους. Επομένως, δυστυχώς, προς το παρόν, για κλινικές ανάγκες, χρησιμοποιούνται ήδη δοκιμασμένες συνήθεις μέθοδοι απομόνωσης και κρυοσυντήρησης κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος, και πιο αποτελεσματικές, αλλά δαπανηρές μέθοδοι παραμένουν η μοίρα των πειραματιστών.

Γενικά, έχουν εγκριθεί κριτήρια για την αξιολόγηση του αριθμού των αιμοποιητικών κυττάρων και οι απαιτήσεις για την εξέταση δειγμάτων ομφαλοπλακουντιακού αίματος για την αναγνώριση μολυσματικών παραγόντων. Προκειμένου να διασφαλιστεί η ασφάλεια της μεταμόσχευσης αιμοποιητικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος, όλα τα δείγματα αίματος πρέπει να εξετάζονται κυρίως για αιματογενώς μεταδιδόμενες λοιμώξεις και γενετικές ασθένειες. Ορισμένοι συγγραφείς προτείνουν πρόσθετες ειδικές μεθόδους για την εξέταση του ομφαλοπλακουντιακού αίματος για τη διάγνωση γενετικών ασθενειών όπως η α-θαλασσαιμία, η δρεπανοκυτταρική αναιμία, η ανεπάρκεια αδενοσίνης δεαμινάσης, η αγαμμασφαιριναιμία Bruton, οι ασθένειες Hurler και Ponter.

Σύμφωνα με τις συστάσεις του L. Ticheli και των συν-συγγραφέων (1998), κάθε δείγμα ομφαλοπλακουντιακού αίματος πρέπει να ελέγχεται για εμπύρηνα κύτταρα, CD34-θετικά κύτταρα και CFU-GM, πρέπει να πραγματοποιείται τυποποίηση HLA και να προσδιορίζεται η ομάδα αίματος σύμφωνα με το ABO και τον παράγοντα Rh του. Επιπλέον, πρέπει να διεξάγονται βακτηριολογική καλλιέργεια, ορολογικές εξετάσεις για λοίμωξη από HIV και κυτταρομεγαλοϊό, HBsAg, ιογενή ηπατίτιδα C, HTLY-I και HTLV-II (λευχαιμία από ανθρώπινα Τ-κύτταρα), σύφιλη και τοξοπλάσμωση. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για τον κυτταρομεγαλοϊό και τη λοίμωξη από HIV είναι υποχρεωτική.

Η διαδικασία λήψης αίματος ομφάλιου λώρου πρέπει να διεξάγεται σύμφωνα με αυστηρά τις αρχές της ιατρικής βιοηθικής. Πριν από τη συλλογή αίματος, είναι απαραίτητο να ληφθεί η συγκατάθεση της εγκύου για την πραγματοποίησή της. Μια προκαταρκτική συζήτηση με την έγκυο γυναίκα για την απόκτηση ενημερωμένης συγκατάθεσης για όλους τους χειρισμούς, από την έκχυση αίματος έως τη συμπλήρωση της τεκμηρίωσης, διεξάγεται μόνο από ιατρικό προσωπικό. Σε καμία περίπτωση δεν επιτρέπεται η διεξαγωγή οποιασδήποτε από αυτές τις διαδικασίες από προσωπικό με βιολογική, χημική, φαρμακευτική ή άλλη μη ιατρική εκπαίδευση, λόγω παραβίασης των καθιερωμένων κανόνων βιοηθικής και ανθρωπίνων δικαιωμάτων. Σε περίπτωση θετικών εξετάσεων για φορέα HBsAg, παρουσίας αντισωμάτων στα παθογόνα της ηπατίτιδας C, της λοίμωξης HIV και της σύφιλης, δεν συλλέγεται αίμα ομφάλιου λώρου και δείγματα ήδη συλλεγμένου αίματος απορρίπτονται και καταστρέφονται. Πρέπει να σημειωθεί ότι η μεταφορά λανθάνουσων λοιμώξεων στα νεογνά είναι πολύ λιγότερο συχνή από ό,τι στους ενήλικες, επομένως, η πιθανότητα αιματογενούς μεταφοράς και ανάπτυξης μολυσματικών επιπλοκών κατά τη διάρκεια εγχύσεων αιμοποιητικών κυττάρων αίματος ομφάλιου λώρου είναι σημαντικά χαμηλότερη από ό,τι στην περίπτωση χρήσης μυελού των οστών από ενήλικα δότη για μεταμόσχευση.

Μια σημαντική πτυχή της κλινικής χρήσης του ομφαλοπλακουντιακού αίματος είναι η αξιολόγηση των μεταμοσχεύσεων, η οποία βασίζεται στον προσδιορισμό της ποσότητας των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων σε ένα δείγμα ομφαλοπλακουντιακού αίματος και των δόσεων των κυττάρων που απαιτούνται για μεταμόσχευση. Προς το παρόν, δεν έχουν ακόμη αναπτυχθεί πρότυπα για τη βέλτιστη ποσότητα κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος που απαιτούνται για μεταμόσχευση. Δεν υπάρχει γενικά αποδεκτή άποψη ακόμη και για συνήθεις παραμέτρους όπως ο αριθμός των CD34-θετικών κυττάρων και η CFU-GM. Μερικοί συγγραφείς αξιολογούν τις δυνατότητες των αιμοποιητικών κυττάρων αναλύοντας μακροχρόνιες καλλιέργειες με προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε μονάδες σχηματισμού αποικιών που είναι κοινές στα κοκκιοκύτταρα, τα ερυθροκύτταρα, τα μονοκύτταρα και τα μεγακαρυοκύτταρα - CFU-GEMM.

Ωστόσο, σε κλινικό περιβάλλον, η τυπική αξιολόγηση μιας μεταμόσχευσης ομφαλοπλακουντιακού αίματος συνήθως περιλαμβάνει μόνο τον προσδιορισμό του αριθμού των εμπύρηνων ή μονοπύρηνων κυττάρων.

Αποθήκευση αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος

Υπάρχουν επίσης ορισμένα προβλήματα στην τεχνολογία αποθήκευσης αιμοποιητικών κυττάρων από αίμα ομφάλιου λώρου. Κατά την κρυοσυντήρηση αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων, προκειμένου να επιτευχθεί ο βέλτιστος τρόπος κατάψυξης, είναι απαραίτητο να μειωθεί όσο το δυνατόν περισσότερο ο όγκος του αίματος ομφάλιου λώρου, καθώς και να αφαιρεθούν εκ των προτέρων τα ερυθροκύτταρα για να αποφευχθεί η αιμόλυση και ο κίνδυνος ανάπτυξης αντίδρασης ασυμβατότητας για αντιγόνα ερυθροκυττάρων (ABO, Rh). Διάφορες μέθοδοι απομόνωσης πυρηνοκυττάρων είναι κατάλληλες για αυτούς τους σκοπούς. Στις αρχές της δεκαετίας του '90 του περασμένου αιώνα, η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος ήταν η απομόνωση πυρηνοκυττάρων σε βαθμίδα πυκνότητας με βάση το Ficoll με πυκνότητα 1,077 g / ml ή το Percoll με πυκνότητα 1,080 g / ml. Ο διαχωρισμός του αίματος ομφάλιου λώρου σε βαθμίδα πυκνότητας επιτρέπει την απομόνωση κυρίως μονοπύρηνων κυττάρων, αλλά οδηγεί σε σημαντικές απώλειες αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων - έως και 30-50%.

Η αποτελεσματικότητα καθίζησης του υδροξυαιθυλικού αμύλου στη διαδικασία απομόνωσης αιμοποιητικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος αξιολογείται διαφορετικά. Μερικοί συγγραφείς επισημαίνουν τη χαμηλή ποιότητα διαχωρισμού χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, ενώ άλλοι ερευνητές, αντίθετα, μεταξύ όλων των πιθανών μεθόδων, δίνουν προτίμηση στην απομόνωση HSC ομφαλοπλακουντιακού αίματος χρησιμοποιώντας διάλυμα υδροξυαιθυλικού αμύλου 6%. Ταυτόχρονα, τονίζεται η υψηλή απόδοση καθίζησης των αιμοποιητικών κυττάρων, η οποία, σύμφωνα με ορισμένα δεδομένα, φτάνει από 84% έως 90%.

Οι υποστηρικτές μιας διαφορετικής άποψης πιστεύουν ότι σχεδόν όλες οι μέθοδοι κλασμάτωσης σχετίζονται με μεγάλες απώλειες πυρηνοποιημένων κυττάρων και προτείνουν τον διαχωρισμό με φυγοκέντρηση, διαιρώντας το αίμα του ομφάλιου λώρου σε 3 κλάσματα: ερυθροκύτταρα, δακτύλιο λευκοκυττάρων και πλάσμα. Απομονώνοντας τα κύτταρα με αυτόν τον τρόπο, οι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι η περιεκτικότητα σε μονοπύρηνα κύτταρα, πρώιμα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα και κύτταρα με ανοσοφαινότυπο CD34+ τελικά ανήλθε στο 90, 88 και 100% του αρχικού επιπέδου, αντίστοιχα. Παρόμοιες τιμές για την αύξηση των κυττάρων αίματος ομφάλιου λώρου που καθαρίστηκαν με αυτή τη μέθοδο ελήφθησαν και από άλλους ερευνητές: μετά την καθίζηση, απομονώθηκαν το 92% των πυρηνοποιημένων κυττάρων, το 98% των μονοπύρηνων κυττάρων, το 96% των CD34-θετικών κυττάρων και το 106% των μονάδων που σχηματίζουν αποικίες.

Στα τέλη της δεκαετίας του 1990, η ζελατίνη χρησιμοποιήθηκε ευρέως ως παράγοντας καθίζησης. Στην κλινική πράξη, η ζελατίνη χρησιμοποιείται για την απομόνωση αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων από το αίμα του ομφάλιου λώρου από το 1994. Όταν χρησιμοποιείται διάλυμα ζελατίνης 3%, η αποτελεσματικότητα της απομόνωσης πυρηνοκυττάρων φτάνει το 88-94%. Η χρήση ζελατίνης σε μεγάλη κλίμακα στη δημιουργία τράπεζας αίματος ομφάλιου λώρου έχει επιβεβαιώσει τα πλεονεκτήματά της έναντι άλλων παραγόντων καθίζησης. Μια συγκριτική ανάλυση της αποτελεσματικότητας όλων των παραπάνω μεθόδων για την απομόνωση πυρηνοκυττάρων υπό τις συνθήκες της διαδοχικής χρήσης τους σε καθένα από τα δείγματα αίματος ομφάλιου λώρου που εξετάστηκαν έχει αποδείξει ότι ένα διάλυμα ζελατίνης 3% είναι ο βέλτιστος παράγοντας καθίζησης όσον αφορά την απόδοση μονοπύρηνων κυττάρων με φαινότυπο CD34+/CD45+, καθώς και όσον αφορά τον αριθμό των CFU-GM και CFU-GEMM. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούν βαθμίδα πυκνότητας Ficoll, καθώς και η χρήση υδροξυαιθυλαμύλου και μεθυλοκυτταρίνης, ήταν σημαντικά λιγότερο αποτελεσματικές, με απώλειες αιμοποιητικών κυττάρων να φτάνουν το 60%.

Η επέκταση των όγκων μεταμόσχευσης βλαστικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος συνδέεται όχι μόνο με την ανάπτυξη μεθόδων για την απόκτησή τους, αλλά και με την αποθήκευσή τους. Υπάρχουν πολλά προβλήματα που σχετίζονται άμεσα με την προετοιμασία του ομφαλοπλακουντιακού αίματος για μακροχρόνια αποθήκευση και την επιλογή της βέλτιστης τεχνολογίας για την κρυοσυντήρηση των δειγμάτων του. Μεταξύ αυτών είναι τα ζητήματα της σκοπιμότητας εκτέλεσης διαδικασιών διαχωρισμού, χρησιμοποιώντας διάφορα μέσα κρυοσυντήρησης και εφαρμόζοντας μεθόδους για την προετοιμασία αποψυγμένων κυττάρων για μεταμόσχευση. Η μεταφορά φυσικών δειγμάτων ομφαλοπλακουντιακού αίματος πραγματοποιείται συχνά από περιοχές απομακρυσμένες από αιματολογικά κέντρα. Από αυτή την άποψη, προκύπτει το πρόβλημα των αποδεκτών περιόδων αποθήκευσης για το ομφαλοπλακουντιακό αίμα από τη στιγμή της απόκτησής του έως την έναρξη της κρυοσυντήρησης, το οποίο έχει ιδιαίτερη σημασία κατά τη δημιουργία τραπεζών ομφαλοπλακουντιακού αίματος.

Μια μελέτη της λειτουργικής δραστηριότητας των αιμοποιητικών κυττάρων στο αίμα του ομφάλιου λώρου μετά από μακροχρόνια αποθήκευση (έως 12 χρόνια) σε υγρό άζωτο έδειξε ότι περίπου το 95% των αιμοποιητικών κυττάρων δεν χάνουν την υψηλή πολλαπλασιαστική τους ικανότητα κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου. Στην εργασία του S. Yurasov και των συν-συγγραφέων (1997), αποδείχθηκε ότι η αποθήκευση του αίματος του ομφάλιου λώρου σε θερμοκρασία δωματίου (22°C) ή στους 4°C για 24 και 48 ώρες δεν μειώνει σημαντικά τη βιωσιμότητα των αιμοποιητικών κυττάρων, η οποία είναι 92 και 88% του αρχικού επιπέδου, αντίστοιχα. Ωστόσο, εάν η περίοδος αποθήκευσης παραταθεί σε τρεις ημέρες, ο αριθμός των βιώσιμων εμπύρηνων κυττάρων στο αίμα του ομφάλιου λώρου μειώνεται σημαντικά. Ταυτόχρονα, άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι όταν αποθηκεύονται για 2-3 ημέρες στους 22 ή 4°C, η βιωσιμότητα των ώριμων κοκκιοκυττάρων, και όχι των αιμοποιητικών κυττάρων, υποφέρει πρωτίστως.

Η βιωσιμότητα των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων του ομφαλοπλακουντιακού αίματος μπορεί να επηρεαστεί αρνητικά από τα συστατικά των συστημάτων συλλογής ομφαλοπλακουντιακού αίματος. Μια ανάλυση της επίδρασης διαφόρων αντιπηκτικών, των οποίων ο μηχανισμός δράσης οφείλεται στη δέσμευση ιόντων ασβεστίου (ACD, EDTA, XAPD-1) στα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα υπό συνθήκες αποθήκευσης ομφαλοπλακουντιακού αίματος για 24 έως 72 ώρες, αποκάλυψε την αρνητική τους επίδραση στη βιωσιμότητα των πυρηνοποιημένων κυττάρων. Από αυτή την άποψη, οι συγγραφείς συνιστούν τη χρήση PBS (ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών) με την προσθήκη φυσικής ηπαρίνης χωρίς συντηρητικό σε συγκέντρωση 20 U/ml, η οποία, κατά τη γνώμη τους, επιτρέπει την αύξηση της περιόδου αποθήκευσης του μη κλασματωμένου ομφαλοπλακουντιακού αίματος σε 72 ώρες και διατηρεί τη λειτουργική δραστηριότητα των μονάδων που σχηματίζουν αποικίες. Ωστόσο, μια μελέτη για την ασφάλεια των CFU-GM και CFU-G έδειξε ότι ο χρόνος αποθήκευσης του ομφαλοπλακουντιακού αίματος πριν από την κρυοσυντήρηση δεν πρέπει να υπερβαίνει τις εννέα ώρες. Προφανώς, η αρχή που πρέπει να ισχύει σε αυτή την περίπτωση είναι ότι, παρουσία αντικρουόμενων δεδομένων, θα πρέπει να χρησιμοποιείται η ελάχιστη συνιστώμενη περίοδος αποθήκευσης για το ομφαλοπλακουντιακό αίμα και η προγραμματισμένη κατάψυξη των απομονωμένων κυττάρων θα πρέπει να ξεκινά το συντομότερο δυνατό.

Κατά την κατάψυξη αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος, συνήθως χρησιμοποιείται διάλυμα DMSO 10% ως κρυοπροστατευτικό. Ωστόσο, εκτός από την έντονη κρυοπροστατευτική δράση, το διμεθυλοσουλφοξείδιο σε μια τέτοια συγκέντρωση έχει επίσης άμεση κυτταροτοξική δράση, ακόμη και με ελάχιστη έκθεση σε αιμοποιητικά κύτταρα ομφαλοπλακουντιακού αίματος. Για τη μείωση της κυτταροτοξικής δράσης του DMSO, χρησιμοποιείται μηδενική θερμοκρασία έκθεσης, αυξάνεται η ταχύτητα όλων των χειρισμών και πραγματοποιούνται πολλαπλές πλύσεις μετά την απόψυξη δειγμάτων ομφαλοπλακουντιακού αίματος.

Από το 1995, το Ινστιτούτο Αιματολογίας και Μεταγγίσεων της Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών της Ουκρανίας αναπτύσσει μια επιστημονική κατεύθυνση που στοχεύει σε μια ολοκληρωμένη μελέτη του αίματος του ομφάλιου λώρου ως εναλλακτική πηγή αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων. Συγκεκριμένα, έχουν αναπτυχθεί νέες τεχνολογίες για την κρυοσυντήρηση σε χαμηλή θερμοκρασία αιμοποιητικών κυττάρων μη κλασματωμένου και κλασματωμένου αίματος του ομφάλιου λώρου. Η χαμηλού μοριακού βάρους ιατρική πολυβινυλοπυρρολιδόνη χρησιμοποιείται ως κρυοπροστατευτικό. Η μέθοδος κρυοσυντήρησης μη κλασματωμένου αίματος του ομφάλιου λώρου βασίζεται σε μια πρωτότυπη τεχνολογία για την προπαρασκευή των κυττάρων για κατάψυξη και σε μια μέθοδο για ειδική επεξεργασία του κυτταρικού εναιωρήματος αμέσως πριν από τη μεταμόσχευση.

Ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες που επηρεάζουν το επίπεδο λειτουργικής δραστηριότητας των κρυοσυντηρημένων αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων είναι ο ρυθμός ψύξης του κυτταρικού εναιωρήματος, ειδικά κατά τη φάση κρυστάλλωσης. Μια προσέγγιση λογισμικού για την επίλυση του προβλήματος της ταχύτητας και του χρόνου κατάψυξης παρέχει μεγάλες ευκαιρίες για τη δημιουργία απλών και εξαιρετικά αποτελεσματικών μεθόδων κρυοσυντήρησης, χωρίς να χρειάζεται πλύσιμο του κυτταρικού εναιωρήματος από τα κρυοπροστατευτικά πριν από τη μεταμόσχευση.

Τα πιο επικίνδυνα στάδια για τη βιωσιμότητα των κυττάρων κατά την παρασκευή τους είναι τα στάδια της άμεσης κατάψυξης και απόψυξης. Κατά την κατάψυξη αιμοποιητικών κυττάρων, ένα σημαντικό μέρος τους μπορεί να καταστραφεί κατά τη στιγμή της μετάβασης του μεσοκυττάριου μέσου από την υγρή στη στερεά φάση - κρυστάλλωση. Για τη μείωση του ποσοστού κυτταρικού θανάτου, χρησιμοποιούνται κρυοπροστατευτικά, οι μηχανισμοί δράσης και η κρυοπροστατευτική αποτελεσματικότητα των οποίων καλύπτονται επαρκώς στην επιστημονική βιβλιογραφία.

Μια πολλά υποσχόμενη κατεύθυνση για τη βελτιστοποίηση των μεθόδων κρυοσυντήρησης για τα κύτταρα του μυελού των οστών και του ομφάλιου λώρου είναι ο συνδυασμός χαμηλών συγκεντρώσεων αρκετών κρυοπροστατευτικών με διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης σε ένα διάλυμα, για παράδειγμα, DMSO που δρα σε ενδοκυτταρικό επίπεδο και υδροξυαιθυλικό άμυλο ή αλβουμίνη, τα οποία έχουν εξωκυτταρική προστατευτική δράση.

Για την κρυοσυντήρηση κυττάρων ομφάλιου λώρου, χρησιμοποιείται παραδοσιακά ένα διάλυμα DMSO 20%, το οποίο χύνεται αργά στο κυτταρικό εναιώρημα με συνεχή μηχανική ανάδευση σε παγόλουτρο μέχρι να επιτευχθεί ίση αναλογία (1:1) όγκων κρυοπροστατευτικού και κυτταρικού εναιωρήματος. Η τελική συγκέντρωση διμεθυλοσουλφοξειδίου είναι 10%. Το κυτταρικό εναιώρημα ψύχεται στη συνέχεια σε προγραμματισμένη κρυογονική μονάδα με ρυθμό GS/min στους -40°C, μετά τον οποίο ο ρυθμός ψύξης αυξάνεται στους 10°C/min. Αφού φτάσουν οι -100°C, το δοχείο με το κυτταρικό εναιώρημα τοποθετείται σε υγρό άζωτο (-196°C). Με αυτήν την τεχνική κρυοσυντήρησης, η διατήρηση των λειτουργικά ενεργών μονοπύρηνων κυττάρων μετά την απόψυξη φτάνει το 85% του αρχικού επιπέδου.

Οι τροποποιήσεις των μεθόδων κρυοσυντήρησης στοχεύουν στη μείωση της συγκέντρωσης DMSO με την προσθήκη υδροξυαιθυλικού αμύλου (οι τελικές συγκεντρώσεις διμεθυλοσουλφοξειδίου και υδροξυαιθυλικού αμύλου είναι 5 και 6% αντίστοιχα). Υψηλή αποτελεσματικότητα ενός τέτοιου συνδυασμού κρυοπροστατευτικών παρατηρείται κατά την κατάψυξη ενός εναιωρήματος μυελοειδών κυττάρων και με όχι λιγότερη κυτταροπροστασία από ό,τι όταν χρησιμοποιείται μόνο ένα διάλυμα 10% διμεθυλοσουλφοξειδίου. Ο αριθμός των βιώσιμων πυρηνοκυττάρων έφτασε το 96,7% του αρχικού επιπέδου και η λειτουργική τους δραστηριότητα, που εκτιμήθηκε με τον αριθμό των CFU-GM, ήταν 81,8%.

Όταν χρησιμοποιείται διάλυμα διμεθυλοσουλφοξειδίου σε συγκεντρώσεις από 5 έως 10% σε συνδυασμό με 4% υδροξυαιθυλαμύλου (τελική συγκέντρωση), διαπιστώθηκε ότι η ασφάλεια των CD34-θετικών κυττάρων σε τέτοιες περιοχές διμεθυλοσουλφοξειδίου παραμένει ουσιαστικά αμετάβλητη. Ταυτόχρονα, όταν η συγκέντρωση διμεθυλοσουλφοξειδίου μειώνεται από 5 σε 2,5%, παρατηρείται μαζικός θάνατος κυττάρων ομφάλιου λώρου - ο αριθμός των βιώσιμων κυτταρικών μονάδων μειώνεται από 85,4 σε 12,2%. Άλλοι συγγραφείς κατέληξαν επίσης στο συμπέρασμα ότι τα διαλύματα διμεθυλοσουλφοξειδίου 5 και 10% (στην εκδοχή του συγγραφέα - σε συνδυασμό με αυτόλογο ορό) παρέχουν κυτταροπροστασία με μέγιστη αποτελεσματικότητα κατά την κρυοσυντήρηση αιμοποιητικών κυττάρων ομφάλιου λώρου. Επιπλέον, παρατηρείται υψηλή συντήρηση διαδοχικά κατεψυγμένων και αποψυγμένων κυττάρων στην περίπτωση συνδυασμού 5 ή 10% διμεθυλοσουλφοξειδίου με διάλυμα υδροξυαιθυλαμύλου 4%, ειδικά με ελεγχόμενο ρυθμό ψύξης GS/min. Σε μια άλλη μελέτη, χρησιμοποιήθηκε ένα κρυοπροστατευτικό διάλυμα που αποτελείται από τρία συστατικά - DMSO, καθαρισμένη ανθρώπινη αλβουμίνη και μέσο RPMI σε αναλογία 1:4:5, το οποίο προστέθηκε στο κυτταρικό εναιώρημα σε αναλογία ίσου όγκου (η τελική συγκέντρωση διμεθυλοσουλφοξειδίου ήταν 5%). Μετά από απόψυξη σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία +4 GS, η διατήρηση των CFU-GM ξεπέρασε το 94%.

Μερικοί συγγραφείς προτείνουν τη χρήση μη κλασματωμένου αίματος ομφάλιου λώρου για κρυοσυντήρηση, καθώς σημαντικές ποσότητες αιμοποιητικών κυττάρων χάνονται κατά τη διαδικασία αφαίρεσης των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Σε αυτήν την παραλλαγή, χρησιμοποιείται διάλυμα 10% διμεθυλοσουλφοξειδίου για την προστασία των μονοπύρηνων κυττάρων από τις βλαβερές συνέπειες της κρυοκρυστάλλωσης. Η κατάψυξη πραγματοποιείται με σταθερό ρυθμό ψύξης GS/min στους -80°C, μετά την οποία το εναιώρημα κυττάρων αίματος ομφάλιου λώρου βυθίζεται σε υγρό άζωτο. Αυτή η μέθοδος κατάψυξης έχει ως αποτέλεσμα μερική λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων, επομένως τα δείγματα αίματος δεν απαιτούν κλασμάτωση. Μετά την απόψυξη, το εναιώρημα κυττάρων πλένεται από την ελεύθερη αιμοσφαιρίνη και το διμεθυλοσουλφοξείδιο σε διάλυμα ανθρώπινης αλβουμίνης ή στον αυτόλογο ορό αίματος του ασθενούς και χρησιμοποιείται για μεταμόσχευση.

Η διατήρηση των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων μετά την απόψυξη του μη κλασματωμένου αίματος ομφάλιου λώρου είναι πράγματι υψηλότερη από αυτή του κλασματωμένου αίματος ομφάλιου λώρου, ωστόσο, λόγω της κρυοσταθερότητας ορισμένων ερυθροκυττάρων, ενδέχεται να προκύψουν σοβαρά προβλήματα μετά τη μετάγγιση λόγω μετάγγισης ερυθροκυττάρων ασύμβατων με το ABO. Επιπλέον, ο όγκος του αποθηκευμένου μη κλασματωμένου αίματος αυξάνεται σημαντικά. Από κλινική άποψη, η κρυοσυντήρηση προηγουμένως απομονωμένων και καθαρισμένων από άλλα κλάσματα κυττάρων αιμοποιητικών κυττάρων αίματος ομφάλιου λώρου εξακολουθεί να είναι προτιμότερη.

Συγκεκριμένα, έχει αναπτυχθεί μια μέθοδος κρυοσυντήρησης κλασματοποιημένων κυττάρων αίματος ομφάλιου λώρου, η οποία επιτρέπει την αφαίρεση ερυθροκυττάρων στο στάδιο της προετοιμασίας για κατάψυξη, στην οποία χρησιμοποιείται διάλυμα 6% υδροξυαιθυλαμύλου ως μέρος του διαλύματος υποκατάστασης πλάσματος "Stabizol". Μετά την απόψυξη, το κυτταρικό εναιώρημα που λαμβάνεται με αυτόν τον τρόπο είναι έτοιμο για κλινική χρήση χωρίς πρόσθετους χειρισμούς.

Έτσι, προς το παρόν υπάρχουν πολλές αρκετά αποτελεσματικές μέθοδοι κρυοσυντήρησης αίματος από τον ομφάλιο λώρο. Η βασική τους διαφορά είναι ότι τα δείγματα αίματος καταψύχονται χωρίς κλάσματα ή υποβάλλονται σε διαχωρισμό σε κυτταρικά κλάσματα στο στάδιο της παρασκευής και παρασκευάζονται πυρηνικά κύτταρα χωρίς ανάμειξη ερυθροκυττάρων.

Μεταμόσχευση αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων ομφάλιου λώρου

Στα τέλη της δεκαετίας του 1980 και στις αρχές της δεκαετίας του 1990, διαπιστώθηκε ότι το αίμα του ομφάλιου λώρου, το οποίο παρέχει στο έμβρυο υποστήριξη ζωής κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης, έχει υψηλή περιεκτικότητα σε αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα. Η σχετική απλότητα της λήψης κυττάρων αίματος του ομφάλιου λώρου και η απουσία προφανών ηθικών προβλημάτων συνέβαλαν στη χρήση βλαστοκυττάρων αίματος του ομφάλιου λώρου στην πρακτική ιατρική. Η πρώτη επιτυχημένη μεταμόσχευση αίματος του ομφάλιου λώρου σε παιδί με αναιμία Fanconi χρησίμευσε ως σημείο εκκίνησης για την επέκταση του όγκου των μεταμοσχεύσεων βλαστοκυττάρων αίματος του ομφάλιου λώρου και τη δημιουργία ενός συστήματος για την τράπεζά του. Στο παγκόσμιο σύστημα τραπεζών αίματος του ομφάλιου λώρου, η μεγαλύτερη είναι το Κέντρο Αίματος Πλακούντα της Νέας Υόρκης, το οποίο βρίσκεται στον ισολογισμό του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας των ΗΠΑ. Ο αριθμός των αποθηκευμένων δειγμάτων αίματος του ομφάλιου λώρου σε αυτήν την τράπεζα πλησιάζει τις 20.000. Ο αριθμός των ληπτών (κυρίως παιδιών) που έχουν υποβληθεί σε επιτυχημένη μεταμόσχευση αυξάνεται επίσης. Σύμφωνα με το Υπουργείο Υγείας των ΗΠΑ, η περίοδος ζωής χωρίς υποτροπές μετά τη μεταμόσχευση των ληπτών μοσχεύματος αίματος του ομφάλιου λώρου υπερβαίνει ήδη τα 10 χρόνια.

Αυτό δεν προκαλεί έκπληξη, καθώς πολυάριθμες μελέτες για το αιμοποιητικό δυναμικό του αίματος από τον ομφάλιο λώρο έχουν δείξει ότι, όσον αφορά την ποσότητα και την ποιότητα των πρώιμων βλαστοκυττάρων, όχι μόνο δεν είναι κατώτερο από τον μυελό των οστών ενός ενήλικα, αλλά τον υπερβαίνει και από ορισμένες απόψεις. Το υψηλότερο πολλαπλασιαστικό δυναμικό των βλαστοκυττάρων του αίματος από τον ομφάλιο λώρο οφείλεται στα οντογενετικά χαρακτηριστικά της κυτταρικής σηματοδότησης, στην παρουσία υποδοχέων για συγκεκριμένους αυξητικούς παράγοντες στο αιμοποιητικό ιστό (HSC), στην ικανότητα των κυττάρων του αίματος από τον ομφάλιο λώρο να παράγουν αυτοκρινείς αυξητικούς παράγοντες και στο μεγάλο μέγεθος και μήκος των τελομερών.

Έτσι, τα γονιδιωματικά και φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων του ομφάλιου λώρου προκαθορίζουν την υψηλής ποιότητας ενσωμάτωση του μοσχεύματος με υψηλό δυναμικό αποκατάστασης της αιμοποίησης του δότη στο σώμα του λήπτη.

Οφέλη των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων του ομφάλιου λώρου

Μεταξύ των πραγματικών πλεονεκτημάτων της χρήσης αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος για μεταμόσχευση σε σχέση με άλλες πηγές αιμοποιητικών κυττάρων, αξίζει να σημειωθεί ο σχεδόν μηδενικός κίνδυνος για την υγεία του δότη (αν δεν λάβουμε υπόψη τον πλακούντα ως τέτοιο) και η απουσία ανάγκης για γενική αναισθησία. Η χρήση ομφαλοπλακουντιακού αίματος διευρύνει τις δυνατότητες μεταμόσχευσης κυττάρων λόγω μερικώς HLA-συμβατών μοσχευμάτων (ασυμβατότητα από ένα έως τρία αντιγόνα). Έχει αναπτυχθεί μια μέθοδος για τη μακροχρόνια αποθήκευση αιμοποιητικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος σε κατεψυγμένη κατάσταση, η οποία αυξάνει την πιθανότητα λήψης σπάνιων τύπων HLA και μειώνει τον χρόνο αναζήτησης ενός HLA-συμβατού μοσχεύματος για αλλογενή μεταμόσχευση. Ταυτόχρονα, μειώνεται σημαντικά ο κίνδυνος ανάπτυξης ορισμένων λανθάνουσων λοιμώξεων που μεταδίδονται με μεταδοτικά μέσα. Επιπλέον, προκύπτει μια φθηνή μορφή βιολογικής ασφάλισης ζωής λόγω της δυνατότητας χρήσης ομφαλοπλακουντιακών κυττάρων για αυτόλογη μεταμόσχευση.

Ωστόσο, λόγω των μικρών όγκων αίματος που μπορούν να συλλεχθούν από τον πλακούντα (κατά μέσο όρο όχι περισσότερο από 100 ml), το πρόβλημα της λήψης της μέγιστης δυνατής ποσότητας αίματος από την ομφάλια φλέβα έρχεται στο προσκήνιο, τηρώντας αυστηρά την προϋπόθεση του ελάχιστου κινδύνου βακτηριακής μόλυνσης των ληφθέντων δειγμάτων αίματος ομφάλιου λώρου.

Τα πρωτόγονα αιμοποιητικά κύτταρα του ομφάλιου λώρου συνήθως αναγνωρίζονται από την παρουσία της γλυκοφωσφοπρωτεΐνης CD34 στην επιφάνειά τους, καθώς και με βάση τις λειτουργικές τους ιδιότητες μελετώντας την κλωνογένεση ή τον σχηματισμό αποικιών in vitro. Η συγκριτική ανάλυση έδειξε ότι στο ομφάλιο λώρο και στον μυελό των οστών η μέγιστη περιεκτικότητα σε CD34-θετικά κύτταρα στο μονοπύρηνο κλάσμα είναι 1,6 και 5,0% αντίστοιχα, το μέγιστο επίπεδο μονάδων σχηματισμού αποικιών στον υποπληθυσμό κυττάρων CD34+ είναι 80 και 25%, η συνολική αποτελεσματικότητα κλωνοποίησης των κυττάρων CD34+ είναι 88 και 58%, η μέγιστη περιεκτικότητα σε κύτταρα σχηματισμού αποικιών με υψηλό δυναμικό πολλαπλασιασμού (HPP-CFC στον πληθυσμό CD34+) είναι 50 και 6,5%. Πρέπει να προστεθεί ότι η αποτελεσματικότητα της κλωνοποίησης κυττάρων CD34+CD38 και η ικανότητα απόκρισης στην διέγερση από κυτοκίνες είναι επίσης υψηλότερες στα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα του ομφάλιου λώρου.

Ο συνδυασμός των φαινοτυπικών αντιγόνων Thy-1, CD34 και CD45RA επιβεβαιώνει το υψηλό πολλαπλασιαστικό δυναμικό των αιμοποιητικών κυττάρων του ομφάλιου λώρου, και η έκφραση αυτών των τριών αντιγόνων στην επιφάνεια των κυττάρων του ομφάλιου λώρου υποδηλώνει την ανήκωσή τους σε βλαστοκύτταρα. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι το ομφάλιο αίμα περιέχει κύτταρα με φαινότυπο CD34+ που δεν έχουν δείκτες γραμμικής διαφοροποίησης. Το επίπεδο των κυτταρικών υποπληθυσμών με το φαινοτυπικό προφίλ CD34+/Lin στο ομφάλιο αίμα είναι περίπου 1% του συνολικού αριθμού των CD34-θετικών κυττάρων. Τα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα του ομφάλιου αίματος δημιουργούν τόσο τη λεμφοειδή κυτταρική σειρά όσο και την πολυδύναμη μυελοειδή σειρά γραμμικής κυτταρικής διαφοροποίησης, γεγονός που υποδηλώνει επίσης την ανήκωσή τους σε βλαστοκύτταρα.

Όπως έχει ήδη αναφερθεί, σημαντικές διαφορές μεταξύ του μυελού των οστών και του αίματος ομφάλιου λώρου εντοπίζονται στην ποσότητα των αιμοποιητικών κυττάρων που χρησιμοποιούνται για μεταμόσχευση και λαμβάνονται κατά τη διάρκεια μίας διαδικασίας συλλογής. Εάν κατά τη μεταμόσχευση μυελού των οστών η απώλεια κυτταρικής μάζας κατά τον διαχωρισμό, την κρυοσυντήρηση, την απόψυξη και τον έλεγχο είναι αποδεκτή εντός 40-50%, τότε για το αίμα ομφάλιου λώρου τέτοιες απώλειες κυττάρων είναι πολύ σημαντικές, καθώς εάν χρησιμοποιηθεί ανεπαρκής ποσότητα HSC, το μόσχευμα μπορεί να αποδειχθεί αναποτελεσματικό. Σύμφωνα με τους G. Kogler et al. (1998), για μεταμόσχευση κυττάρων με σωματικό βάρος λήπτη 10 kg, όλα τα δείγματα αίματος ομφάλιου λώρου μπορούν να είναι πιθανά μοσχεύματα (ο συνολικός αριθμός των συλλεγόμενων δειγμάτων αίματος ομφάλιου λώρου είναι 2098), με σωματικό βάρος 35 kg - 67%, και μόνο το 25% των δειγμάτων μπορεί να παρέχει αποτελεσματική μεταμόσχευση σε ασθενείς με σωματικό βάρος 50-70 kg. Αυτή η κλινική κατάσταση υποδεικνύει την ανάγκη βελτιστοποίησης και βελτίωσης της αποτελεσματικότητας των υπαρχουσών μεθόδων συλλογής, αναπαραγωγής και αποθήκευσης κυττάρων αίματος ομφάλιου λώρου. Ως εκ τούτου, η βιβλιογραφία συζητά ευρέως τα ζητήματα της τυποποίησης των μεθόδων συλλογής, ελέγχου, διαχωρισμού και κρυοσυντήρησης του ομφάλιου λώρου για τη δημιουργία τραπεζών αίματος, της χρήσης του στην κλινική, και επίσης ορίζει τους όρους και τους όρους αποθήκευσης των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων του ομφάλιου λώρου.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Χρήση αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος στην ιατρική

^{Συνήθως, είναι δυνατή η απομόνωση έως και 106} αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων από το αίμα του ομφάλιου λώρου, σπάνια περισσότερο. Από αυτή την άποψη, το ερώτημα κατά πόσον μια τέτοια ποσότητα αιμοποιητικών κυττάρων από το αίμα του ομφάλιου λώρου επαρκεί για την αποκατάσταση της αιμοποίησης σε έναν ενήλικα λήπτη παραμένει ανοιχτό μέχρι σήμερα. Οι απόψεις επί του θέματος διίστανται. Ορισμένοι ερευνητές πιστεύουν ότι μια τέτοια ποσότητα είναι αρκετά επαρκής για μεταμόσχευση σε παιδιά, αλλά πολύ μικρή για μεταμόσχευση σε έναν ενήλικα, για τον οποίο η βέλτιστη ποσότητα είναι η εισαγωγή (7-10) x 106 ^CD34 -θετικών κυττάρων ανά 1 kg σωματικού βάρους - κατά μέσο όρο 7 x 108 ^ανά μεταμόσχευση. Από αυτούς τους υπολογισμούς προκύπτει ότι ένα δείγμα αίματος του ομφάλιου λώρου περιέχει 700 φορές λιγότερα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα από ό,τι απαιτείται για μία μεταμόσχευση σε έναν ενήλικα ασθενή. Ωστόσο, μια τέτοια ποσοτική αξιολόγηση γίνεται κατ' αναλογία με τον αριθμό των μεταγγιζόμενων κυττάρων μυελού των οστών και δεν λαμβάνει καθόλου υπόψη τα οντογενετικά χαρακτηριστικά της αιμοποίησης.

Συγκεκριμένα, αγνοείται το γεγονός ότι τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα του ομφάλιου λώρου έχουν υψηλότερο πολλαπλασιαστικό δυναμικό σε σύγκριση με τα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα του μυελού των οστών. Τα αποτελέσματα μελετών δυναμικού σχηματισμού αποικιών in vitro υποδηλώνουν ότι μία δόση ομφάλιου λώρου είναι ικανή να παρέχει ανασύσταση της αιμοποίησης σε ενήλικα λήπτη. Από την άλλη πλευρά, δεν πρέπει να ξεχνάμε ότι ο αριθμός των βλαστοκυττάρων του ομφάλιου λώρου μειώνεται ακόμη και κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη: η περιεκτικότητα σε CD34-θετικά κύτταρα στο ομφάλιο λώρο μειώνεται γραμμικά κατά 5 φορές στην περίοδο από 20 εβδομάδες (το αίμα για τη μελέτη ελήφθη κατά την πρόωρη διακοπή της κύησης) έως 40 εβδομάδες κύησης (η περίοδος του φυσιολογικού τοκετού), η οποία συνοδεύεται από παράλληλη, μόνιμα αυξανόμενη έκφραση γραμμικών δεικτών κυτταροδιαφοροποίησης.

Λόγω της έλλειψης τυποποιημένης προσέγγισης για τον ποσοτικό προσδιορισμό των προγονικών κυττάρων σε δείγματα αίματος ομφάλιου λώρου, οι συζητήσεις σχετικά με τη βέλτιστη δόση αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων αίματος ομφάλιου λώρου συνεχίζονται. Ορισμένοι ερευνητές πιστεύουν ότι ο αριθμός των εμπύρηνων κυττάρων και των μονοπύρηνων κυττάρων που υπολογίζονται εκ νέου για το σωματικό βάρος του λήπτη, δηλαδή η δόση τους, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως κριτήριο για την επιλογή δειγμάτων αίματος ομφάλιου λώρου. Ορισμένοι συγγραφείς πιστεύουν ότι το ελάχιστο ποσοτικό όριο των κυττάρων CD34+ ακόμη και για την αυτομεταμόσχευση αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων είναι 2 x 106 ^/ kg. Ταυτόχρονα, η αύξηση της δόσης των αιμοποιητικών κυττάρων σε 5 x 106 ^{κύτταρα} /kg (μόνο 2,5 φορές) εξασφαλίζει ήδη μια πιο ευνοϊκή πορεία της πρώιμης περιόδου μετά τη μεταμόσχευση, μειώνει τη συχνότητα εμφάνισης λοιμωδών επιπλοκών και μειώνει τη διάρκεια της προληπτικής αντιβιοτικής θεραπείας.

Σύμφωνα με τους E. Gluckman et al. (1998), στην ογκοαιματολογία, η προϋπόθεση για την επιτυχή μεταμόσχευση ομφαλοπλακουντιακών κυττάρων είναι η εισαγωγή τουλάχιστον 3,7 x 10 ⁷ εμπύρηνων κυττάρων ανά 1 kg σωματικού βάρους του λήπτη. Όταν η δόση των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων μειώνεται σε 1 x 10 ⁷ ή λιγότερα εμπύρηνα κύτταρα ανά 1 kg σωματικού βάρους του ασθενούς, ο κίνδυνος αποτυχίας μεταμόσχευσης και υποτροπής του καρκίνου του αίματος αυξάνεται απότομα. Θα πρέπει να αναγνωριστεί ότι ο ελάχιστος αριθμός προγονικών κυττάρων που απαιτείται για την ταχεία αποκατάσταση της αιμοποίησης μετά από αλλομεταμόσχευση αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων είναι ακόμη άγνωστος. Θεωρητικά, αυτό μπορεί να επιτευχθεί χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο, αλλά στην κλινική πρακτική της μεταμόσχευσης μυελού των οστών, η ταχεία και σταθερή ενσωμάτωση του μοσχεύματος εξασφαλίζεται με τη μετάγγιση τουλάχιστον (1-3) x 10 ⁸ εμπύρηνων κυττάρων ανά 1 kg σωματικού βάρους του ασθενούς.

Μια πρόσφατη λεπτομερής μελέτη για τον προσδιορισμό του βέλτιστου αριθμού αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (HSCs) στην ογκοαιματολογία περιελάμβανε την παρατήρηση ασθενών σε τρεις ομάδες, οι οποίες κατανεμήθηκαν ανάλογα με την περιεκτικότητα σε CD34-θετικά κύτταρα στο μεταμοσχευμένο υλικό. Στους ασθενείς της πρώτης ομάδας χορηγήθηκαν (3-5) x 106 ^{κύτταρα} /kg. Η δόση HSC σε ασθενείς της δεύτερης ομάδας ήταν (5-10) x 106 ^{κύτταρα} /kg, και στους ασθενείς της τρίτης ομάδας μεταμοσχεύθηκαν περισσότερα από 10 x 106 ^{κύτταρα} CD34+/kg. Τα καλύτερα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στην ομάδα των ληπτών που έλαβαν μόσχευμα με αριθμό CD34-θετικών κυττάρων ίσο με (3-5) x 106 ^/ kg. Με αύξηση της δόσης των μεταμοσχευμένων κυττάρων πάνω από 5 x 106 ^/ kg, δεν αποκαλύφθηκαν στατιστικά σημαντικά πλεονεκτήματα. Σε αυτή την περίπτωση, η πολύ υψηλή περιεκτικότητα σε HSCs στο μόσχευμα (> 10 x 106 ^/ kg) σχετίζεται με την επανέγχυση σημαντικού αριθμού υπολειμματικών καρκινικών κυττάρων, η οποία οδηγεί σε υποτροπή της νόσου. Δεν έχει τεκμηριωθεί άμεση σχέση μεταξύ του αριθμού των μεταμοσχευμένων αλλογενών προγονικών κυττάρων και της ανάπτυξης της αντίδρασης μοσχεύματος έναντι ξενιστή.

Η συσσωρευμένη παγκόσμια εμπειρία από τη μεταμόσχευση ομφαλοπλακουντιακού αίματος επιβεβαιώνει το υψηλό δυναμικό ανασύστασης του πληθυσμού τους. Ο ρυθμός ενσωμάτωσης του μοσχεύματος ομφαλοπλακουντιακού αίματος συσχετίζεται με τον αριθμό των εισαγόμενων εμπύρηνων κυττάρων. Τα καλύτερα αποτελέσματα παρατηρούνται με μεταμόσχευση 3 x 107 ^/ kg, ενώ για τον μυελό των οστών αυτή η δόση είναι 2 x 108 ^/ kg. Σύμφωνα με τα στοιχεία των συντονιστικών κέντρων, στα τέλη του 2000, πραγματοποιήθηκαν παγκοσμίως 1200 μεταμοσχεύσεις ομφαλοπλακουντιακών κυττάρων, κυρίως από συγγενείς δότες (83%). Είναι προφανές ότι το ομφαλοπλακουντιακό αίμα θα πρέπει να θεωρείται ως εναλλακτική λύση αντί του μυελού των οστών για μεταμόσχευση σε ασθενείς με αιμοβλαστώσεις.

Ταυτόχρονα, η νεογνική φύση της πηγής αιμοποιητικού ιστού από τον ομφάλιο λώρο εμπνέει αισιοδοξία λόγω της παρουσίας λειτουργικών χαρακτηριστικών του αιμοποιητικού ιστού του. Ταυτόχρονα, μόνο η κλινική εμπειρία μπορεί να απαντήσει στο ερώτημα της επάρκειας ενός δείγματος αίματος ομφάλιου λώρου για την αποκατάσταση της αιμοποίησης σε έναν ενήλικα λήπτη με αιματοποιητική απλασία. Η μεταμόσχευση κυττάρων αίματος ομφάλιου λώρου χρησιμοποιείται σε προγράμματα θεραπείας για πολλές νεοπλασματικές και μη νεοπλασματικές ασθένειες: λευχαιμία και μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα, μη Hodgkin λέμφωμα και νευροβλάστωμα, απλαστική αναιμία, συγγενείς αναιμίες Fanconi και Diamond-Blackfan, ανεπάρκεια προσκόλλησης λευκοκυττάρων, σύνδρομο Barr, νόσο Gunther, σύνδρομο Hurler, θαλασσαιμία.

Οι ανοσολογικές πτυχές της μεταμόσχευσης αιμοποιητικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος αξίζουν ιδιαίτερης προσοχής και ξεχωριστής μελέτης. Έχει αποδειχθεί ότι στην περίπτωση μεταμόσχευσης βλαστικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος από δότες με ατελή συμβατότητα HLA, τα αποτελέσματα της μεταμόσχευσης είναι αρκετά ικανοποιητικά, γεγονός που, σύμφωνα με τους συγγραφείς, υποδηλώνει χαμηλότερη ανοσοαντιδραστικότητα των κυττάρων του ομφαλοπλακουντιακού αίματος από ό,τι του μυελού των οστών.

Μια λεπτομερής μελέτη της κυτταρικής σύνθεσης του αίματος του ομφάλιου λώρου αποκάλυψε τα χαρακτηριστικά τόσο του φαινοτυπικού φάσματος των δραστικών κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος όσο και της λειτουργικής τους δραστηριότητας, γεγονός που κατέστησε δυνατή την εξέταση του αίματος του ομφάλιου λώρου ως πηγής αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (HSCs) με σχετικά χαμηλό κίνδυνο ανάπτυξης αντίδρασης «μοσχεύματος έναντι ξενιστή». Μεταξύ των σημείων λειτουργικής ανωριμότητας των ανοσοεπαρκών κυττάρων του αίματος του ομφάλιου λώρου, είναι απαραίτητο να σημειωθεί η ανισορροπία στην παραγωγή κυτοκινών και η μείωση της ευαισθησίας στη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης από τις κυτοκίνες. Η προκύπτουσα αναστολή της δραστηριότητας των κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων θεωρείται παράγοντας που συμβάλλει στον σχηματισμό ανοσολογικής ανοχής στον μεταμοσχευμένο αιμοποιητικό ιστό. Στον πληθυσμό των λεμφοκυττάρων του αίματος του ομφάλιου λώρου, σε αντίθεση με το περιφερικό αίμα και τον μυελό των οστών των ενήλικων δοτών, κυριαρχούν τα ανενεργά, ανώριμα λεμφοκύτταρα και τα κατασταλτικά κύτταρα. Αυτό υποδηλώνει μειωμένη ετοιμότητα των Τ-λεμφοκυττάρων του αίματος του ομφάλιου λώρου για ανοσοαπόκριση. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του μονοκυτταρικού πληθυσμού των κυττάρων του αίματος του ομφάλιου λώρου είναι η χαμηλή περιεκτικότητα σε λειτουργικά πλήρη και ενεργά κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνο.

Αφενός, η χαμηλή ωριμότητα των κυττάρων-τελεστών του ανοσοποιητικού συστήματος στο αίμα του ομφάλιου λώρου διευρύνει τις ενδείξεις για τη χρήση του στην κλινική πράξη, καθώς αυτά τα χαρακτηριστικά παρέχουν μείωση της έντασης της ανοσολογικής σύγκρουσης μεταξύ των κυττάρων του δότη και του λήπτη. Αλλά, από την άλλη πλευρά, είναι γνωστή η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ του βαθμού ανάπτυξης της αντίδρασης "μοσχεύματος έναντι ξενιστή" και του αντικαρκινικού αποτελέσματος της μεταμόσχευσης, δηλαδή της ανάπτυξης του φαινομένου "μοσχεύματος έναντι λευχαιμίας". Από αυτή την άποψη, διεξήχθη μια μελέτη σχετικά με την αντικαρκινική κυτταροτοξικότητα των κυττάρων του αίματος του ομφάλιου λώρου. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δείχνουν ότι, παρά την πραγματικά εξασθενημένη απόκριση των ανοσοεπαρκών κυττάρων του αίματος του ομφάλιου λώρου στην αντιγονική διέγερση, τα λεμφοκύτταρα που ενεργοποιούνται κυρίως είναι φυσικοί φονείς και κύτταρα-φονείς που συμμετέχουν ενεργά στους μηχανισμούς εφαρμογής της αντικαρκινικής κυτταροτοξικότητας. Επιπλέον, βρέθηκαν υποπληθυσμοί λεμφοκυττάρων με τους φαινοτύπους CD16+CD56+ και CD16"TCRa/p+ στο αίμα του ομφάλιου λώρου. Υποτίθεται ότι αυτά τα κύτταρα στην ενεργοποιημένη μορφή τους εφαρμόζουν την αντίδραση "μοσχεύματος έναντι λευχαιμίας".

Στο Ινστιτούτο Ογκολογίας της Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών της Ουκρανίας, χορηγήθηκαν κρυοσυντηρημένα αιμοποιητικά κύτταρα ομφάλιου λώρου σε καρκινοπαθείς με επίμονη αιμοποιητική υποπλασία λόγω χημειοθεραπείας και ακτινοθεραπείας. Σε αυτούς τους ασθενείς, η μεταμόσχευση αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων ομφάλιου λώρου αποκατέστησε αρκετά αποτελεσματικά την καταστολή της αιματοποίησης, όπως αποδεικνύεται από τη επίμονη αύξηση της περιεκτικότητας σε ώριμα σχηματισμένα στοιχεία στο περιφερικό αίμα, καθώς και από την αύξηση των δεικτών που χαρακτηρίζουν την κατάσταση της κυτταρικής και χυμικής ανοσίας. Η σταθερότητα του φαινομένου αναπληθυσμού μετά τη μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων ομφάλιου λώρου επιτρέπει τη συνέχιση της ακτινοβολίας και της χημειοθεραπείας χωρίς διακοπή της πορείας της θεραπείας. Υπάρχουν πληροφορίες για υψηλότερη αποτελεσματικότητα της αλλομεταμόσχευσης βλαστικών κυττάρων ομφάλιου λώρου σε ογκοαιματολογικούς ασθενείς: ο ετήσιος κίνδυνος υποτροπής μιας νεοπλασίας με τη χρήση τους ήταν 25% έναντι 40% σε ασθενείς με μεταμοσχευμένο αλλογενή μυελό των οστών.

Ο μηχανισμός δράσης των κρυοσυντηρημένων βλαστοκυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος θα πρέπει να θεωρείται ως αποτέλεσμα της χυμικής διέγερσης της αιμοποίησης του λήπτη, η οποία προκαλείται από τη μοναδική ικανότητα των νεογνικών κυττάρων να παράγουν αυτοκρινείς αιμοποιητικούς αυξητικούς παράγοντες, καθώς και ως συνέπεια της προσωρινής ενσωμάτωσης κυττάρων δότη (όπως αποδεικνύεται από μια αξιόπιστη αύξηση της περιεκτικότητας σε εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη στο περιφερικό αίμα των ληπτών την 7-15η ημέρα μετά τη μετάγγιση σε σύγκριση με τα αρχικά δεδομένα). Η απουσία αντιδράσεων μετά τη μετάγγιση σε λήπτες ομφαλοπλακουντιακού αίματος είναι αποτέλεσμα της σχετικής ανοχής των ανοσοεπαρκών κυττάρων του, καθώς και ενός κριτηρίου εμπιστοσύνης για τη βιολογική επάρκεια του κρυοσυντηρημένου υλικού.

Τα προγονικά κύτταρα-δολοφόνοι Τ-λεμφοκυττάρων του ομφάλιου λώρου είναι ικανά να ενεργοποιούνται υπό την επίδραση εξωγενούς διέγερσης κυτοκινών, η οποία χρησιμοποιείται για την ανάπτυξη νέων μεθόδων ex vivo και in vivo για την πρόκληση αντικαρκινικής κυτταροτοξικότητας των λεμφοειδών στοιχείων του μοσχεύματος για επακόλουθη ανοσοθεραπεία. Επιπλέον, η «ανωριμότητα» του γονιδιώματος των ανοσοεπαρκών κυττάρων του ομφάλιου λώρου τους επιτρέπει να χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση της αντικαρκινικής δράσης χρησιμοποιώντας μεθόδους μοριακής μοντελοποίησης.

Σήμερα, το ομφαλοπλακουντιακό αίμα έχει βρει ευρεία εφαρμογή κυρίως στην παιδιατρική αιματολογία. Σε παιδιά με οξεία λευχαιμία, η αλλομεταμόσχευση αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος, σε σύγκριση με την αλλομεταμόσχευση μυελού των οστών, μειώνει σημαντικά τη συχνότητα εμφάνισης της νόσου μοσχεύματος έναντι ξενιστή. Ωστόσο, αυτό συνοδεύεται από μεγαλύτερη περίοδο ουδετερο- και θρομβοπενίας και, δυστυχώς, υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας 100 ημερών μετά τη μεταμόσχευση. Μια μεγαλύτερη περίοδος ανάκτησης των επιπέδων κοκκιοκυττάρων και αιμοπεταλίων στο περιφερικό αίμα μπορεί να οφείλεται σε ανεπαρκή διαφοροποίηση μεμονωμένων υποπληθυσμών CD34-θετικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος, όπως αποδεικνύεται από το χαμηλό επίπεδο απορρόφησης ραδιενεργού ροδαμίνης και τη χαμηλή έκφραση αντιγόνων CD38 στην επιφάνειά τους.

Ταυτόχρονα, η μεταμόσχευση αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων από ομφάλιο λώρο σε ενήλικες ασθενείς, η οποία πραγματοποιήθηκε λόγω απουσίας τόσο συμβατού μη συγγενούς δότη μυελού των οστών όσο και της πιθανότητας κινητοποίησης αυτόλογων αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (HSCs), έδειξε υψηλή επιβίωση χωρίς υποτροπή ενός έτους στην ομάδα ασθενών κάτω των 30 ετών (73%). Η επέκταση του ηλικιακού εύρους των ληπτών (18-46 ετών) οδήγησε σε μείωση της επιβίωσης στο 53%.

Η ποσοτική ανάλυση των κυττάρων με τον φαινότυπο CD34+ στον μυελό των οστών και στο αίμα ομφάλιου λώρου αποκάλυψε υψηλότερη (3,5 φορές) περιεκτικότητά τους στον μυελό των οστών, αλλά παρατηρήθηκε σημαντική υπεροχή κυττάρων με το φαινοτυπικό προφίλ CD34+HLA-DR στο αίμα ομφάλιου λώρου. Είναι γνωστό ότι τα κύτταρα του αίματος με τους ανοσολογικούς δείκτες CD34+HLA-DR πολλαπλασιάζονται πιο ενεργά από τα κύτταρα με τον ανοσοφαινότυπο CD34+HLA-DR+, κάτι που επιβεβαιώθηκε σε πειραματικές μελέτες ανάπτυξης μακροχρόνιας καλλιέργειας αιμοποιητικών κυττάρων in vitro. Οι πρόδρομοι πρωτόγονων κυττάρων με τον φαινότυπο CD34+CD38 περιέχονται τόσο στο αίμα ομφάλιου λώρου όσο και στον μυελό των οστών, αλλά τα κύτταρα αίματος ομφάλιου λώρου με το σύνολο δεικτών CD34+CD38 έχουν υψηλότερη κλωνογενετική δράση από τα αιμοποιητικά κύτταρα του ίδιου φαινοτύπου που απομονώθηκαν από τον μυελό των οστών ενήλικων δοτών. Επιπλέον, τα κύτταρα ομφαλικού αίματος με ανοσοφαινότυπο CD34+CD38 πολλαπλασιάζονται ταχύτερα σε απόκριση στην διέγερση από κυτοκίνες (IL-3, IL-6, G-CSF) και παράγουν 7 φορές περισσότερες αποικίες σε μακροχρόνιες καλλιέργειες από τα κύτταρα μυελού των οστών.

Τράπεζες Βλαστοκυττάρων Ομφάλιου Λώρου

Για την ορθή ανάπτυξη ενός νέου τομέα της πρακτικής ιατρικής - της μεταμόσχευσης βλαστικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος, καθώς και για την εφαρμογή μεταμοσχεύσεων αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων μυελού των οστών, είναι απαραίτητο να υπάρχει ένα εκτεταμένο δίκτυο τραπεζών αίματος, το οποίο έχει ήδη δημιουργηθεί στις ΗΠΑ και την Ευρώπη. Τα εγχώρια δίκτυα τραπεζών ομφαλοπλακουντιακού αίματος ενώνονται από τον Σύνδεσμο Τραπεζών Netcord. Η σκοπιμότητα δημιουργίας ενός διεθνούς συνδέσμου τραπεζών ομφαλοπλακουντιακού αίματος καθορίζεται από το γεγονός ότι απαιτείται μεγάλος αριθμός δειγμάτων ομφαλοπλακουντιακού αίματος για την εκτέλεση μη σχετιζόμενων μεταμοσχεύσεων, γεγονός που επιτρέπει την επιλογή ενός δότη πανομοιότυπου με HLA. Μόνο η δημιουργία ενός συστήματος τραπεζών με αποθήκευση δειγμάτων αίματος διαφόρων τύπων HLA μπορεί πραγματικά να λύσει το πρόβλημα της εύρεσης του απαραίτητου δότη. Η οργάνωση ενός τέτοιου συστήματος τραπεζών ομφαλοπλακουντιακού αίματος απαιτεί προκαταρκτική ανάπτυξη ηθικών και νομικών κανόνων, οι οποίοι συζητούνται επί του παρόντος σε διεθνές επίπεδο.

Για τη δημιουργία τραπεζών ομφαλοπλακουντιακού αίματος στην Ουκρανία, πρέπει να εκπονηθεί μια ολόκληρη σειρά κανονισμών και εγγράφων.

Καταρχάς, πρόκειται για ζητήματα τυποποίησης των μεθόδων συλλογής, κλασμάτωσης και κατάψυξης του ομφάλιου λώρου. Είναι απαραίτητο να ρυθμιστούν οι κανόνες συλλογής του ομφάλιου λώρου στα μαιευτήρια σύμφωνα με τις απαιτήσεις της ιατρικής δεοντολογίας, για να καθοριστεί ο ελάχιστος όγκος ομφάλιου λώρου που εξασφαλίζει την επιτυχή μεταμόσχευση. Είναι απαραίτητο να συγκριθούν και να τυποποιηθούν διάφορα κριτήρια για την αξιολόγηση της ποιότητας και της ποσότητας των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων, καθώς και οι μέθοδοι τυποποίησης HLA και οι διαγνωστικές μέθοδοι για γενετικές και μολυσματικές ασθένειες που μπορούν να μεταδοθούν κατά την έγχυση κυττάρων ομφάλιου λώρου, για να καθοριστούν κοινά κριτήρια για την επιλογή υγιών δοτών. Αξίζει επίσης να συζητηθούν τα ζητήματα της δημιουργίας ξεχωριστών εγκαταστάσεων αποθήκευσης για ορό, κύτταρα και DNA που λαμβάνονται από ομφάλιο λώρο.

Είναι απολύτως απαραίτητο να οργανωθεί ένα δίκτυο υπολογιστών με δεδομένα ομφαλοπλακουντιακού αίματος για σύνδεση με μητρώα δοτών μυελού των οστών. Για την περαιτέρω ανάπτυξη της κυτταρικής μεταμόσχευσης, είναι απαραίτητο να αναπτυχθούν ειδικά πρωτόκολλα για τη σύγκριση των αποτελεσμάτων της μεταμόσχευσης ομφαλοπλακουντιακού αίματος και μυελού των οστών από συγγενείς πανομοιότυπους με HLA και μη συγγενείς δότες. Η τυποποίηση της τεκμηρίωσης, συμπεριλαμβανομένης της ενημερωμένης συγκατάθεσης των γονέων, καθώς και η ενημέρωση της μητέρας ή των συγγενών σχετικά με γενετικές και/ή μολυσματικές ασθένειες που ανιχνεύονται στο παιδί, μπορεί να βοηθήσει στην επίλυση των ηθικών και νομικών προβλημάτων της κλινικής χρήσης των κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος.

Η καθοριστική προϋπόθεση για την ανάπτυξη της κυτταρικής μεταμόσχευσης στην Ουκρανία θα είναι η υιοθέτηση του Εθνικού Προγράμματος Δωρεάς Βλαστοκυττάρων και η ανάπτυξη διεθνούς συνεργασίας με άλλες χώρες μέσω του Παγκόσμιου Συνδέσμου Δωρητών Μυελού των Οστών (WMDA), του Εθνικού Προγράμματος Δωρητών Μυελού των Οστών των ΗΠΑ (NMDP) και άλλων μητρώων.

Συνοψίζοντας την ακόμη σύντομη ιστορία της ανάπτυξης της μεταμόσχευσης αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος, σημειώνουμε ότι οι πρώτες υποθέσεις σχετικά με τη δυνατότητα χρήσης ομφαλοπλακουντιακού αίματος σε μια κλινική, που εκφράστηκαν στις αρχές της δεκαετίας του '70, επιβεβαιώθηκαν τη δεκαετία του '80 από τα αποτελέσματα πειραματικών μελετών σε ζώα, και το 1988 πραγματοποιήθηκε η πρώτη παγκοσμίως μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος σε άνθρωπο, μετά την οποία άρχισε να δημιουργείται ένα παγκόσμιο δίκτυο τραπεζών ομφαλοπλακουντιακού αίματος. Σε 10 χρόνια, ο αριθμός των ασθενών με μεταμοσχευμένα αιμοποιητικά κύτταρα ομφαλοπλακουντιακού αίματος πλησίασε τους 800. Μεταξύ αυτών ήταν ασθενείς με διάφορες ασθένειες όγκων (λευχαιμία, λέμφωμα, συμπαγείς όγκοι) και μη όγκων (συγγενείς ανοσοανεπάρκειες, αναιμία, ασθένειες που σχετίζονται με μεταβολικές διαταραχές) φύσης.

Η περιεκτικότητα σε πρώιμα και δεσμευμένα προδρόμους κυττάρων στο αίμα του ομφάλιου λώρου είναι υψηλότερη από ό,τι στο περιφερικό αίμα ενός ενήλικα. Όσον αφορά τον αριθμό των μονάδων σχηματισμού αποικιών κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων και το πολλαπλασιαστικό τους δυναμικό, το αίμα του ομφάλιου λώρου υπερβαίνει σημαντικά το περιφερικό αίμα των ενηλίκων, ακόμη και μετά την εισαγωγή αυξητικών παραγόντων. Σε μακροχρόνιες κυτταροκαλλιέργειες in vitro, έχει παρατηρηθεί μεγαλύτερη πολλαπλασιαστική δραστηριότητα και βιωσιμότητα των κυττάρων του ομφάλιου λώρου από ό,τι των κυττάρων του μυελού των οστών. Κρίσιμες στιγμές στη μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων αίματος ομφάλιου λώρου είναι ο αριθμός και το αιμοποιητικό δυναμικό των εμπύρηνων κυττάρων, η παρουσία λοίμωξης από κυτταρομεγαλοϊό, η συμβατότητα HLA του δότη και του λήπτη, το σωματικό βάρος και η ηλικία του ασθενούς.

Ωστόσο, η μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος θα πρέπει να θεωρείται ως εναλλακτική λύση στη μεταμόσχευση μυελού των οστών για τη θεραπεία σοβαρών αιματολογικών παθήσεων, κυρίως σε παιδιά. Τα κλινικά προβλήματα της μεταμόσχευσης βλαστικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος επιλύονται σταδιακά - υπάρχουν ήδη αρκετά αποτελεσματικές μέθοδοι για τη συλλογή, τον διαχωρισμό και την κρυοσυντήρηση των κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος, παρέχονται συνθήκες για τον σχηματισμό τραπεζών ομφαλοπλακουντιακού αίματος και βελτιώνονται οι μέθοδοι για τον έλεγχο των εμπύρηνων κυττάρων. Το διάλυμα ζελατίνης 3% και το διάλυμα υδροξυαιθυλαμύλου 6% θα πρέπει να θεωρούνται βέλτιστα για τον διαχωρισμό κατά τη διάρκεια της μεγάλης κλίμακας προμήθειας αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος κατά τη δημιουργία τραπεζών.

Ο P. Perekhrestenko και οι συν-συγγραφείς (2001) ορθώς σημειώνουν ότι η μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος θα πρέπει να λάβει τη θέση που της αξίζει στο σύμπλεγμα θεραπευτικών μέτρων για την αντιμετώπιση των αιμοποιητικών καταθλίψεων ποικίλης γένεσης, καθώς τα βλαστικά κύτταρα ομφαλοπλακουντιακού αίματος έχουν μια σειρά από σημαντικά πλεονεκτήματα, μεταξύ των οποίων τα πιο σημαντικά είναι η σχετική απλότητα της προμήθευσής τους, η απουσία κινδύνου για τον δότη, η χαμηλή μόλυνση των νεογνικών κυττάρων με ιούς και το συγκριτικά χαμηλό κόστος μεταμόσχευσης. Μερικοί συγγραφείς επισημαίνουν ότι η μεταμόσχευση ομφαλοπλακουντιακών κυττάρων συνοδεύεται λιγότερο συχνά από επιπλοκές που σχετίζονται με την αντίδραση μοσχεύματος έναντι ξενιστή από τη μεταμόσχευση κυττάρων μυελού των οστών, η οποία οφείλεται, κατά τη γνώμη τους, στην ασθενή έκφραση αντιγόνων HLA-DR στα κύτταρα ομφαλοπλακουντιακού αίματος και στην ανωριμότητά τους. Ωστόσο, ο κύριος πληθυσμός των εμπύρηνων κυττάρων στο ομφαλοπλακουντιακό αίμα είναι τα Τ λεμφοκύτταρα (CD3-θετικά κύτταρα), η περιεκτικότητα των οποίων είναι περίπου 50%, δηλαδή 20% μικρότερη από ό,τι στο περιφερικό αίμα ενός ενήλικα, αλλά οι φαινοτυπικές διαφορές στους υποπληθυσμούς Τ κυττάρων από αυτές τις πηγές είναι ασήμαντες.

Μεταξύ των παραγόντων που επηρεάζουν άμεσα το ποσοστό επιβίωσης στη μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος, αξίζει να σημειωθεί η ηλικία των ασθενών (τα καλύτερα αποτελέσματα παρατηρούνται σε λήπτες ηλικίας από ενός έως πέντε ετών), η έγκαιρη διάγνωση της νόσου και η μορφή της λευχαιμίας (η αποτελεσματικότητα είναι σημαντικά υψηλότερη στην οξεία λευχαιμία). Μεγάλη σημασία έχει η δόση των εμπύρηνων κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος, καθώς και η συμβατότητά τους με HLA με τον λήπτη. Δεν είναι τυχαίο ότι η ανάλυση της κλινικής αποτελεσματικότητας της μεταμόσχευσης βλαστικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος στην ογκοαιματολογία δείχνει τα καλύτερα αποτελέσματα θεραπείας με τη χρήση σχετικών μοσχευμάτων: η επιβίωση ενός έτους χωρίς υποτροπή σε αυτή την περίπτωση φτάνει το 63%, ενώ με μη σχετιζόμενη μεταμόσχευση - μόνο το 29%.

Έτσι, η παρουσία μεγάλου αριθμού βλαστοκυττάρων στο αίμα του ομφάλιου λώρου και η υψηλή ικανότητα αναπλήρωσης των νεογνικών αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων επιτρέπουν τη χρήση τους για αλλογενή μεταμόσχευση σε ογκοαιματολογικούς ασθενείς. Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι η ανασύσταση της αιμοποίησης μετά τη μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων αίματος του ομφάλιου λώρου «παρατείνεται έγκαιρα»: η αποκατάσταση της περιεκτικότητας σε ουδετερόφιλα στο περιφερικό αίμα παρατηρείται συνήθως μέχρι το τέλος της 6ης εβδομάδας και η θρομβοπενία συνήθως εξαφανίζεται μετά από 6 μήνες. Επιπλέον, η ανωριμότητα των αιμοποιητικών κυττάρων αίματος του ομφάλιου λώρου δεν αποκλείει ανοσολογικές συγκρούσεις: σοβαρή οξεία και χρόνια νόσος μοσχεύματος έναντι ξενιστή παρατηρείται στο 23 και 25% των ληπτών, αντίστοιχα. Υποτροπές οξείας λευχαιμίας μέχρι το τέλος του πρώτου έτους μετά τη μεταμόσχευση κυττάρων αίματος του ομφάλιου λώρου παρατηρούνται στο 26% των περιπτώσεων.

[ 10 ], [ 11 ]