Η μη-ιική γονιδιακή θεραπεία προσφέρει ελπίδα για τον χρόνιο πόνο στην πλάτη

Σε μια πρόσφατη μελέτη που δημοσιεύτηκε στο περιοδικό Biomaterials, οι ερευνητές ανέπτυξαν μια νέα μη ιική γονιδιακή θεραπεία για τη θεραπεία του δισκογενούς πόνου στην πλάτη (DBP) χορηγώντας τον μεταγραφικό παράγοντα Forkhead Box F1 (FOXF1) χρησιμοποιώντας τροποποιημένα εξωκυτταρικά κυστίδια (eEVs) σε εκφυλιστικούς μεσοσπονδύλιους δίσκους (IVDs) in vivo.

Ο χρόνιος πόνος στη μέση (LBP) αποτελεί ένα αυξανόμενο παγκόσμιο πρόβλημα λόγω της γήρανσης του πληθυσμού και της επιδείνωσης των προβλημάτων με τα οπιοειδή. Οι τρέχουσες θεραπείες περιλαμβάνουν βραχυπρόθεσμη ανακούφιση ή δαπανηρές χειρουργικές επεμβάσεις, υπογραμμίζοντας την ανάγκη για μη εθιστικές και λιγότερο επεμβατικές θεραπείες.

Οι τρέχουσες βιολογικές προσεγγίσεις, συμπεριλαμβανομένης της χορήγησης αυξητικών παραγόντων, της κυτταρικής θεραπείας και της ιικής γονιδιακής θεραπείας, μπορούν να μειώσουν την εκφύλιση σε ζωικά και ανθρώπινα μοντέλα. Ωστόσο, ζητήματα όπως οι βραχυπρόθεσμες επιπτώσεις, η κακή μακροπρόθεσμη αποτελεσματικότητα και η περιττή ανοσογονικότητα και ογκογονικότητα μπορεί να εμποδίσουν την άμεση εφαρμογή αυτών των προσεγγίσεων.

Σε αυτή τη μελέτη, οι ερευνητές δημιούργησαν μια μη ιική γονιδιακή θεραπεία για την εκφύλιση του μεσοσπονδύλιου δίσκου (IVD) χρησιμοποιώντας FOXF1-eEV.

Οι ερευνητές μετεμβολίασαν πρωτογενείς εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού (PMEF) με πλασμίδια που περιείχαν FOXF1 ή pCMV6 ως έλεγχο και χαρακτήρισαν δείγματα eEV χρησιμοποιώντας δοκιμασία παρακολούθησης νανοσωματιδίων (NTA).

Αξιολόγησαν την αποτελεσματική φόρτωση μοριακού φορτίου σε eEVs χρησιμοποιώντας ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qRT-PCR) και συμβατική PCR. Η ανάλυση Western blot ταυτοποίησε πρωτεΐνες FOXF1 και ειδικές για EVs σε σχηματισμούς eEVs. Η ομάδα χρησιμοποίησε πλασμίδια που ενισχύουν τις άνω και κάτω περιοχές πολυσυνδέτη για να προσδιορίσει την παρουσία πλασμιδιακού DNA FOXF1 σε κύτταρα δότες και δημιούργησε eEVs.

Εξέτασαν το πλήρους μήκους mRNA που παράγεται από πλασμιδιακό DNA σε eEVs και κύτταρα-δότες.

Οι ερευνητές δημιούργησαν εξωκυτταρικά κυστίδια με παράγοντες μεταγραφής για να αποκαταστήσουν τη λειτουργία των ιστών και να τροποποιήσουν τις αντιδράσεις στον πόνο σε ένα ζωικό μοντέλο DBP.

Εντόπισαν ηλεκτροφόρα κύτταρα (EVs) για τη μεταφορά και κατανομή του FOXF1 σε κατεστραμμένους μεσοσπονδύλιους δίσκους σε ένα μοντέλο ποντικού με δισκογενή πόνο στην πλάτη, για να προσδιορίσουν την αναστολή του FOXF1 eEV στην εκφύλιση του μεσοσπονδύλιου δίσκου.

Η ομάδα συνδύασε βιομηχανικές δοκιμές μεσοσπονδύλιων δίσκων ποντικών με απεικόνιση, αλλαγές στην εξωκυττάρια μήτρα (ECM) και αντιδράσεις στον πόνο που αξιολογήθηκαν μετά από 12 εβδομάδες για να επιβεβαιώσει τις αλλαγές στη δομή και τη λειτουργία, καθώς και τον πόνο, που προκλήθηκαν από τη θεραπευτική παρέμβαση.

Οι προεγχειρητικές και μετεγχειρητικές αξιολογήσεις του πόνου περιελάμβαναν μικροαξονική τομογραφία (micro-CT), μαγνητική τομογραφία (MRI), μηχανικές δοκιμές, χρώση με μπλε της Αλκίας (AB) και κόκκινο πικροσίριο (PSR), δοκιμή μπλε του διμεθυλενίου και ανοσοϊστοχημεία (IHC).

Η μελέτη περιελάμβανε μια χειρουργική τεχνική κατά την οποία οι ερευνητές χορήγησαν βουπρενορφίνη ER υποδόρια σε ποντίκια για τον έλεγχο του μετεγχειρητικού πόνου.

Η ομάδα διεξήγαγε αξιολογήσεις συμπεριφοράς πριν από τη χειρουργική επέμβαση και κάθε δύο εβδομάδες από τέσσερις έως 12 εβδομάδες μετά την επέμβαση, χρησιμοποιώντας μια ποικιλία μεθόδων, όπως η δοκιμή ανοιχτού πεδίου, η ψυχρή πλάκα, η ανάρτηση ουράς και η ανάρτηση σύρματος.

Η δοκιμή ανοιχτού πεδίου αξιολόγησε την αυθόρμητη δραστηριότητα των ποντικών. Οι δοκιμές ψυχρής πλάκας μέτρησαν τη θερμική υπεραλγησία. Οι δοκιμές ανάρτησης ουράς μέτρησαν τον αξονικό πόνο και οι δοκιμές ανάρτησης σύρματος μέτρησαν τη δύναμη.

Δώδεκα εβδομάδες μετά την επέμβαση, η ομάδα ανέτμησε την οσφυϊκή μοίρα των ζώων χρησιμοποιώντας ανίχνευση μηριαίου νεύρου και αρτηρίας για να εντοπίσει μεσοσπονδύλιους δίσκους μεταξύ L4 και L5, L5 και L6, και L6 και S1 IVD. Χρησιμοποίησαν την L5/L6 IVD για να αξιολογήσουν την ιστολογία και να προσδιορίσουν την περιεκτικότητα σε γλυκοζαμινογλυκάνες (GAG).

Τα FOXF1 eEVs μείωσαν σημαντικά τις αντιδράσεις στον πόνο, αποκαθιστώντας παράλληλα τη δομή και τη λειτουργία των IVD, συμπεριλαμβανομένου του βελτιωμένου ύψους του δίσκου, της ενυδάτωσης των ιστών, της περιεκτικότητας σε πρωτεογλυκάνες και των μηχανικών ιδιοτήτων.

Η μελέτη επικεντρώθηκε στην απελευθέρωση eEVs φορτωμένων με FOXF1 από πρωτογενείς ινοβλάστες που είχαν μεταμοσχευθεί με τον παράγοντα μεταγραφής FOXF1. Η ποσοτική RT PCR έδειξε σημαντική αύξηση στα επίπεδα μεταγραφής mRNA FOXF1 και στα επίπεδα mRNA FOXF1 πλήρους μήκους που είχαν μεταγραφεί σε σύγκριση με τα κύτταρα που είχαν μεταμοσχευθεί με pCMV6.

Η θεραπεία με FOXF1 eEV μπορεί να μειώσει τις αντιδράσεις πόνου σε μοντέλο παρακέντησης οσφυϊκού δίσκου σε ποντίκια για έως και 12 εβδομάδες. Τα θηλυκά ποντίκια εμφάνισαν μεγαλύτερους χρόνους επιληπτικών κρίσεων στην ομάδα που έλαβε FOXF1 σε σχέση με την ομάδα των τραυματιών, οι οποίοι διήρκεσαν τουλάχιστον 12 εβδομάδες μετά τη θεραπεία.

Η θεραπεία με FOXF1 eEV βελτίωσε την ενυδάτωση και το ύψος των ιστών στην ενδοσκοπική ενδαρτερεκτομή (IVD) σε τραυματισμένα και εκφυλιστικά ζώα in vivo, διατηρώντας παράλληλα τα επίπεδα ενυδάτωσης και την ένταση της εικόνας T2-σταθμισμένης στο δίσκο IVD.

Ωστόσο, η ομάδα παρατήρησε μείωση στο ύψος του δίσκου σε τραυματισμένα ζώα και σε ζώα που έλαβαν pCMV6 eEV. Τα ποντίκια που έλαβαν FOXF1 eEV δεν παρουσίασαν μείωση στο ύψος του δίσκου 12 εβδομάδες μετά τη θεραπεία. Το φύλο δεν επηρέασε τα λειτουργικά αποτελέσματα.

Τα FOXF1 eEVs αποκατέστησαν τη μηχανική λειτουργία των κατεστραμμένων και εκφυλισμένων IVDs in vivo. Υπό αξονική τάση, τα IVD που υποβλήθηκαν σε αγωγή με FOXF1 eEVs εμφάνισαν υψηλότερη κανονικοποιημένη ακαμψία NZ σε σύγκριση με τα κατεστραμμένα IVDs.

Υπό συνθήκες ερπυσμού, τα κατεστραμμένα IVD εμφάνισαν αυξημένες κανονικοποιημένες μετατοπίσεις ερπυσμού, υποδεικνύοντας μείωση στην κανονικοποιημένη ελαστική ακαμψία ερπυσμού.

Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μείωση της περιεκτικότητας σε GAG σε κατεστραμμένα IVD αυξάνει τη μηχανική ευελιξία, αλλά η θεραπεία με eEV αποτρέπει την απώλεια γλυκοζαμινογλυκανών και τις επακόλουθες αλλαγές στη μηχανική λειτουργία.

Τα FOXF1 eEVs προκάλεσαν δομικές και λειτουργικές αλλαγές στην ενδοσκοπική νόσο (IVD) αυξάνοντας τα επίπεδα πρωτεογλυκάνης και GAG.

Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι τα eEVs φορτωμένα με αναπτυξιακούς παράγοντες μεταγραφής μπορούν να θεραπεύσουν επώδυνες αρθρικές παθήσεις όπως η διαστολική αρτηριακή πίεση (DBP), χορηγώντας αυτούς τους παράγοντες μεταγραφής σε εκφυλιστικές και επώδυνες αρθρώσεις μέσω ενδοφλέβιας χορήγησης (IVD).

Αυτή η στρατηγική μπορεί να βοηθήσει στη μείωση των δομικών και λειτουργικών ανωμαλιών που προκαλούνται από την ασθένεια και στη ρύθμιση των αντιδράσεων στον πόνο με τρόπο που να ταιριάζει στο φύλο.

Οι ερευνητές συνέστησαν επίσης τη χρήση αναπτυξιακών μεταγραφικών παραγόντων όπως ο FOXF1 για τη μετατόπιση των εκφυλιστικών νανοσωματιδίων σε μια προ-αναβολική κατάσταση in vivo. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να προσδιοριστεί η θεραπευτική τους αποτελεσματικότητα.